【凝膠色譜法的原理和方法】血紅蛋白的提取和分離

1、2009年江蘇省洪澤中學(xué)高三生物第一輪復(fù)習(xí)教學(xué)案高三生物備課組1【課題】：課題課題6血紅蛋白的提取和分離血紅蛋白的提取和分離【備課人】：【備課時間備課時間】：【上課時間上課時間】：【課型】：復(fù)習(xí)：復(fù)習(xí)【課時數(shù)】：1課時課時【復(fù)習(xí)目標(biāo)復(fù)習(xí)目標(biāo)】本課題通過嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，使學(xué)生能夠體驗從復(fù)雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法，并了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理，為今后學(xué)習(xí)運用這些技術(shù)打下基礎(chǔ)?！緩?fù)習(xí)重點與難點

2、復(fù)習(xí)重點與難點】復(fù)習(xí)重點：凝膠色譜法的原理和方法。復(fù)習(xí)難點：樣品的預(yù)處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填?！局R回顧知識回顧】：一、實驗原理一、實驗原理蛋白質(zhì)的物化理性質(zhì)：形狀、大小、電荷性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質(zhì)。1凝膠色譜法（分配色譜法）：凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙多孔凝膠顆粒的間隙，路程短路程短，流動快流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆

3、粒內(nèi)部，路程長，流動慢多孔凝膠顆粒內(nèi)部，路程長，流動慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過程：混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子＊洗脫洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質(zhì)分子的差速流動。（4）作用：分離蛋白質(zhì)，測定生物大分子分子量，蛋白質(zhì)的脫鹽等。2緩沖溶液緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應(yīng)的強(qiáng)堿弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4

4、Na2HPO4等），調(diào)節(jié)酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持的干擾而保持pH穩(wěn)定。穩(wěn)定。3凝膠電泳法：凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小帶電性質(zhì)、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場中的運動方向和運動速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。2009年江蘇省洪澤中學(xué)

5、高三生物第一輪復(fù)習(xí)教學(xué)案高三生物備課組34.4.純度鑒定純度鑒定SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）三、注意事項三、注意事項1.電泳技術(shù)電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達(dá)到對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。2.紅細(xì)胞的洗滌如果分層不明顯分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和離心速度過高和時間過長時間過長，會使

6、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。3如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。4為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？

7、如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。5沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的不但節(jié)約時間節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣排除凝膠內(nèi)的空氣。6G75“G”代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍，75表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5g。7裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠