人工改造豬血紅蛋白和重組松弛素受體蛋白的制備和性能.pdf

1、論文分別采用人工化學(xué)改造和基因重組改造技術(shù)手段，分別對血紅蛋白和松馳素受體蛋白這兩類功能性蛋白進行結(jié)構(gòu)改造，以獲得更適于研究和應(yīng)用需求的人工改造蛋白。
　　血液資源緊缺和血源性污染等問題促使人們研究和開發(fā)血液代用品，其中以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品備受關(guān)注。動物血資源豐富、價廉且易于避免和控制污染，是代血物的首選原料。
　　多年來國內(nèi)外研究主要集中在牛血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品。而豬血在我國來源廣泛，取材容易，價格低廉，且其

2、結(jié)構(gòu)和性能與人血紅蛋白十分接近，免疫原性低，氧親和調(diào)節(jié)機制與人血紅蛋白相同，是人血紅蛋白的理想替代物。
　　本論文選擇豬血為原料經(jīng)分離純化制備無基質(zhì)豬血紅蛋白，利用多種化學(xué)修飾手段改造豬血紅蛋白，并對修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、攜氧性能等進行了研究。
　　針對脫離紅細胞后的血紅蛋白容易解聚和氧親和力過高等問題，采用氧化棉子糖、雙3，5二溴水楊酸延胡索酸酯(DBBF)等小分子化合物對豬血紅蛋白進行人工修飾。SDS-PAGE分析表明，經(jīng)小分

3、子修飾后的血紅蛋白都發(fā)生了亞基間的共價交聯(lián)。
　　在脫氧狀態(tài)下，氧化開環(huán)棉子糖修飾后的豬血紅蛋白的半飽和氧分壓(P50值)為2.93kPa，希爾系數(shù)為2.1;氧解離曲線較未經(jīng)修飾的豬血紅蛋白明顯右移，有利于調(diào)整修飾產(chǎn)物的攜氧能力。
　　在脫氧條件下經(jīng)DBBF修飾，豬血紅蛋白攜氧能力得到改善。在反應(yīng)混合物中加入IHP，產(chǎn)物的P50明顯升高。對DBBF修飾血紅蛋白的反應(yīng)條件進行分析，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩者摩爾濃度比為2∶1，反應(yīng)時間2小時，

4、產(chǎn)物的P50值為3.07kPa，希爾系數(shù)為2.2。
　　聚乙二醇修飾蛋白可以增加蛋白分子量，延長其在體內(nèi)循環(huán)時間，還可鈍化其免疫原性。采用4種不同方法活化PEG并對豬血紅蛋白進行修飾，比較了它們的修飾效率、修飾產(chǎn)物的攜氧功能和穩(wěn)定性等。
　　進一步考察采用PEG和DBBF聯(lián)合修飾豬血紅蛋白的效應(yīng)。結(jié)果證明聯(lián)合修飾產(chǎn)物具有穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)，半飽和氧分壓P50在3.33kPa左右，接近于生理條件下人體紅細胞的P50值。
　

5、　通過檢測人工修飾產(chǎn)物對家兔的免疫原性，及靜脈輸注修飾產(chǎn)物對家兔腎、肝、心臟等重要臟器的影響，初步評價了人工改造豬血紅蛋白的生物安全性。
　　松弛素家族肽不僅是影響受精、著床、妊娠、分娩、哺乳的重要生殖激素，它還對維持心臟、血管、腎臟和腦的功能起重要作用，它可能還與某些腫瘤的發(fā)生有關(guān)。全面闡明這類激素的生物學(xué)功能及其作用機理對相關(guān)疾病的治療和藥物開發(fā)具有極其重要的意義。通過基因克隆手段表達激素受體是研究受體-配體作用機制和篩選相應(yīng)

6、藥物的新思路。
　　通過基因重組手段對松弛素受體蛋白進行改造:將松弛素家族肽受體1(RXFP1)或松弛素家族肽受體2（RXFP2）的胞外域與T細胞表面抗原CD8的基因片段重組裝入質(zhì)粒pcDNA3.1/zeo，后者轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，通過篩選培養(yǎng)獲得RXFP1胞外域（即7BP）和CD8融合蛋白的表達細胞株，以及（RXFP2）胞外域（即8BP）和CD8融合蛋白的表達細胞株。經(jīng)放射性配體結(jié)合試驗表明，7BP轉(zhuǎn)染細胞表面具有與H2和H

7、3松弛素高度親和的結(jié)合位點，與報道的RXFP1特征相似;而8BP轉(zhuǎn)染細胞表面呈現(xiàn)與胰島素樣肽-3(INSL3)高度親和的結(jié)合位點，它與H2松弛素也有較高的親和性，但幾乎不結(jié)合H3松弛素，這些都符合RXFP2的特征。以上結(jié)果表明，兩種受體胞外域都已正確錨定在轉(zhuǎn)染細胞表面。
　　在受體蛋白胞外域的N端設(shè)計FLAG標(biāo)簽，在胞外域蛋白與T細胞表面抗原CD8跨膜域之間設(shè)計凝血酶切割位點。穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)染細胞在含5IU/ml凝血酶的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)

8、3天后，可從培養(yǎng)液中獲得從細胞表面酶切下的7BP或8BP蛋白。通過Ni螯合Sepharose和FLAG親合色譜分離純化，獲得純7BP或8BP蛋白。33P-釋放素的交聯(lián)實驗表明，可溶性純7BP保留結(jié)合松馳素的性能。純化的7BP蛋白能特異性抑制由松馳素引發(fā)細胞內(nèi)cAMP水平上升的現(xiàn)象。這表明7BP是良好的RXFP1的功能拮抗物。
　　利用7BP蛋白的FLAG親和末端，將7BP固定在蛋白芯片表面，以固定化7BP蛋白芯片和SELDI-MS