dns-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離血紅蛋白和魚精蛋白

1、實(shí)驗(yàn)七： DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白,背 景,層析法也稱色譜法，是1906年俄國(guó)植物學(xué)家Michael Tswett發(fā)現(xiàn)并命名的。他將植物葉子的色素通過(guò)裝填有吸附劑的柱子，各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)，由此得名為“色譜法”（Chromatography) 。后來(lái)無(wú)色物質(zhì)也可利用吸附柱層析分離。英國(guó)生物學(xué)家Martin和Synge。他們首先提出了色譜塔板理論。1944年出現(xiàn)

2、紙層析以后，層析法不斷發(fā)展，相繼出現(xiàn)薄層層析、親和層析、凝膠層析、氣相層析、高壓液相層析等。,葉綠素通過(guò)碳酸鈣管柱所形成的色譜圖,層析的兩種相,固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動(dòng)相：在層析過(guò)程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動(dòng)相。

3、在柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過(guò)固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，即各組分所受的固定相的阻力和流動(dòng)相的推力影響不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。,按層析過(guò)程的機(jī)理分類：分配層析: 根據(jù)不同組分在不同溶劑中分配系數(shù)不同而使物質(zhì)分離的方法稱為分配層析。

4、吸附層析:吸附是兩相成一界面，溶質(zhì)在表面密集的現(xiàn)象。以吸附劑為固定相，根據(jù)待分離物與吸附劑之間吸附力不同而達(dá)到分離目的的一種層析技術(shù)稱為吸附層析。常用吸附劑：活性碳、硅。離子交換層析: 是以離子交換劑為固定相，根據(jù)物質(zhì)酸堿度、極性和分子大小差異而將物質(zhì)予以分離的一種方法。凝膠層析（分子篩）利用凝膠顆粒形成具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過(guò)或“篩”的作用。親和層析是利用生物分子間所具有的專一性親和力的層析技術(shù)。,

5、層析法分類,層析法分類,按兩相所處的狀態(tài)分類：流動(dòng)相有兩種狀態(tài)：液體作為流動(dòng)相 氣體作為流動(dòng)相固定相也有兩種狀態(tài)：固體吸附劑作為固定相 以吸附在固體上的液體作為固定相按兩相所處的狀態(tài)分為：液相層析和氣相層析,層析法分類,按操作形式不同分類：,吸附層析,原理：任何兩個(gè)相都可以形成表面，其中一個(gè)相的物質(zhì)或溶解在其中的溶質(zhì)在此表面密集現(xiàn)象稱為吸附，利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)具有不同吸附力使混合物得到分的現(xiàn)象就叫吸附層析。凡能將其他物質(zhì)聚

6、集到自己表面的物質(zhì)稱吸附劑，包括硅皮、氧化鋁、活性炭、淀粉、纖維素及陶土，而聚集于聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱被吸附劑。吸附劑與被吸附劑之間的作用除了物理作用外，還有化學(xué)作用，如DNS-氨基酸雙向聚酰胺薄膜層析時(shí)中被分離的物質(zhì)之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于二者之間形成氫鍵。,分配層析技術(shù) （液-液層析法）,原理：利用混合物在兩種不相混溶的液相（固定相和流動(dòng)相）之間的分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離各組分的目的。紙層析是最廣泛的一種分配層析。

7、特點(diǎn)：液-液層析法適合于分離同系物或同分異構(gòu)體,分配層析技術(shù),分配系數(shù)小的溶質(zhì)在流動(dòng)相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)快；分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相中分配的數(shù)量多，移動(dòng)慢。因此可彼此分開(kāi)。分配系數(shù)主要與下列因素有關(guān)： ① 被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)； ② 固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)； ③ 層析柱的溫度。,相關(guān)的概念（一）： 分配系數(shù)：當(dāng)一種溶質(zhì)分布在兩個(gè)互不相溶的溶劑中時(shí)，它在固定相和流動(dòng)相兩相內(nèi)的

8、濃度之比是個(gè)常數(shù)，稱為分配系數(shù)(Kd)。分配系數(shù)是層析中分離純化物質(zhì)的主要依據(jù) Kd=Cs/Cm 其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動(dòng)相中的濃度,分配層析技術(shù),相關(guān)的概念（二）：遷移率：在一定條件下，在相同的時(shí)間內(nèi)某一組分在固定相移動(dòng)

9、的距離與流動(dòng)相本身移動(dòng)的距離之比值。常用Rf來(lái)表示。物質(zhì)在一定溶劑中的分配系數(shù)是一定的， Rf值也是恒定的，因此可以根據(jù)Rf值來(lái)鑒定被分離的物質(zhì)。,原理聚酰胺薄膜層析是一類特殊的分配層析?；旌衔镫S流動(dòng)相通過(guò)聚酰胺薄膜時(shí)，由于被分離物質(zhì)與薄膜形成氫鍵，而各物質(zhì)形成氫鍵的能力不同，決定吸附力的差異，吸附力強(qiáng),展層速度慢，吸附力弱，展層速度快。展層溶劑與被分離物質(zhì)與聚酰胺薄膜表面的離子競(jìng)爭(zhēng)形成氫鍵，選擇適當(dāng)?shù)恼箤尤軇?，使被分離物質(zhì)在溶劑

10、與聚酰胺薄膜表面之間的分配系數(shù)有最大差異。易溶于展層劑的所受的動(dòng)力作用大，展層速度快，反之，速度慢。,DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析,本實(shí)驗(yàn)中，聚酰胺上的氨基與氨基酸（AA）的羰基形成氫鍵，酰胺基團(tuán)上羰基與AA中羥基或酚基形成氫鍵。由于有些AA結(jié)構(gòu)相似，如只采用一種溶劑系統(tǒng)進(jìn)行單向?qū)游?，難達(dá)到完全分離的目的。因此可選擇另一溶劑系統(tǒng)進(jìn)行第二向?qū)游?。這種層析方法稱為雙向?qū)游觥?

11、 第一向：苯－冰醋酸溶劑 第二向：甲酸－水顯色：二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）可與氨基酸的游離氨基結(jié)合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外光下呈黃色熒光。,實(shí)驗(yàn)操作,DNS-氨基酸的制備（已完成）混合DNS－氨基酸的雙向?qū)游鳇c(diǎn)樣：在薄膜右下角距兩邊各0.6cm，直徑控制在2～3mm之間，點(diǎn)在無(wú)光

12、澤面，可重復(fù)點(diǎn)樣2-3次；苯－冰醋酸層析：將點(diǎn)好樣品的薄膜用回形針固定放入展層劑中，展層劑前緣在距薄膜頂端2mm處即可停止,冷風(fēng)吹干，紫外燈下觀察；甲酸－水層析：調(diào)轉(zhuǎn)90度與第一相垂直，放入展層劑中，熱風(fēng)吹干，紫外燈下觀察，用鉛筆輕輕標(biāo)記（以免損壞薄膜表面）；分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；將層析后標(biāo)記好的薄膜以點(diǎn)樣點(diǎn)為左下角貼于實(shí)驗(yàn)報(bào)告中。,3、操作注意事項(xiàng)：嚴(yán)格控制點(diǎn)樣位置以及點(diǎn)樣直徑。展層時(shí)勿將點(diǎn)樣點(diǎn)浸入展層劑中。展層后必須經(jīng)電吹風(fēng)將

13、膜吹干。紫外光對(duì)眼睛有害不要把頭伸到燈下觀察。,DNS-氨基酸的雙向?qū)游鲱A(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,凝膠層析技術(shù),概念：凝膠層析又稱分子篩層析、排阻層析，當(dāng)生物大分子隨流動(dòng)相通過(guò)裝有作為固定相的凝膠顆粒的層析柱時(shí)，根據(jù)它們分子大小不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。原理：凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過(guò)層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來(lái)；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在

14、柱內(nèi)經(jīng)過(guò)的路程較長(zhǎng)移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來(lái)。,凝膠層析的原理分子大小不同混合物上柱； 洗脫開(kāi)始，小分子擴(kuò)散進(jìn)人凝膠顆粒內(nèi)，大分子被排阻于顆粒之外；大小分子分開(kāi)： 大分子行程較短，已洗脫出層析柱，小分子尚在進(jìn)行中。,,凝膠顆粒是一類具有三維空間多孔性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，不帶電荷，可起濾過(guò)或“篩”的作用。,凝膠層析的基本概念,外水體積是指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動(dòng)相的體積。內(nèi)水體積是指凝膠顆粒中孔穴

15、的體積，凝膠層析中固定相體積就是指內(nèi)水體積?；|(zhì)體積是指凝膠顆粒實(shí)際骨架體積。柱床體積就是指凝膠柱所能容納的總體積。洗脫體積是指將樣品中某一組分洗脫下來(lái)所需洗脫液的體積。我們?cè)O(shè)柱床體積為Vt，外水體積為Vo，內(nèi)水體積為Vi，基質(zhì)體積為Vg，則有：Vt＝Vo＋Vi＋Vg 由于Vg相對(duì)很小，可以忽略不計(jì)，則有：Vt＝Vo＋Vi,,凝膠層析柱各種體積示意圖（陰影部分）,當(dāng)分子的Kd＝0時(shí)，Ve＝Vo即該分子被完全排阻于凝膠顆粒之外

16、，全部分布于流動(dòng)相里，固定相里分布為零（A)；當(dāng)分子的Kd＝1時(shí)，Ve＝Vo+Vi即該分子完全不被排阻，均勻的分布在流動(dòng)相和固定相里，兩相比值為1(C)；當(dāng)0 < Kd <1時(shí)， Ve = Vo + Kd*Vi即表明分子受到部分排阻(B)。,實(shí)驗(yàn)原理由于Hb（紅色，分子量64500）與二硝苯-魚精蛋白（黃色，分子量2000-12000）的分子量不同，通過(guò)交聯(lián)葡聚糖凝膠G-50（sephadex）層析柱用蒸餾水洗脫分離。

17、從顏色不同可直接觀察到血紅蛋白洗脫較快，魚精蛋白洗脫較慢。,凝膠層析分離血紅蛋白與魚精蛋白,G類葡聚糖凝膠（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一種以右旋葡萄糖為殘基的多糖，分子間主要是α-1,6-糖苷鍵（約占95%），分枝為l,3-糖苷鍵（約占5%），以1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷為交聯(lián)劑將鏈狀結(jié)構(gòu)連接為三維空間的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。,葡聚糖凝膠網(wǎng)孔大小可通過(guò)調(diào)節(jié)交聯(lián)劑和葡聚糖的配比及反應(yīng)條件來(lái)控制。交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，

18、吸水膨脹就越小。交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，吸水膨脹就越大。G類葡聚糖凝膠常用G-X代表，X數(shù)字既代表交聯(lián)度，也代表特水量。X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于分離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于分離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量，如G-25表示1g干膠持水2.5ml，G-100表示 1g干膠持水10ml，依次類推。,裝柱前準(zhǔn)備: 先用自來(lái)水洗凈,再用蒸餾水洗凈,之后往層析柱加入2-3ml蒸餾水,以

19、確保凝膠底部沒(méi)有氣泡；裝柱：垂直裝柱，待凝膠裝至柱高的10-15cm即可（裝柱的時(shí)候注意要不斷混勻凝膠）。注意防止氣泡與分層, 否則重新裝柱?？捎貌０魯嚢枋贡砻嫫秸?；平衡：反復(fù)加蒸餾水,平衡10分鐘.使蒸餾水維持在3-4cm高度；加樣：待蒸餾水流至柱平面時(shí)（不可使柱平面干掉），馬上靠近柱平面小心滴加4滴樣品（注意盡量不要使床面攪動(dòng)），待樣品浸入到凝膠中后馬上加入3－4滴蒸餾水(動(dòng)作輕柔)，反復(fù)兩次，然后加大量蒸餾水洗脫；收集樣品

20、：樣品一旦加入后馬上用量筒收集流出液，注意向柱床上不斷加水，記錄紅色流出一半時(shí)的毫升數(shù)（血紅蛋白的Ve，也即Vo），繼續(xù)收集，記錄黃色流出一半時(shí)體積（魚精蛋白Ve）；,實(shí)驗(yàn)操作,思考題,按層析過(guò)程的機(jī)理分類，DNS-氨基酸的雙向聚酰胺薄膜層析屬于分配層析、吸附層析、離子交換層析、凝膠層析、親和層析法的哪一種？試述其機(jī)理？經(jīng)測(cè)定甲蛋白Kd=0，乙蛋白kd=0.75，試問(wèn)（1）甲乙二蛋白哪一先從凝膠層析柱上洗脫下來(lái)？甲乙兩蛋白分子量哪個(gè)大