人胎兒血紅蛋白(HbF)膠體金免疫層析快速診斷試條的研制.pdf

1、背景與目的
　　 產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷或出生前診斷,是近30年發(fā)展起來(lái)的一個(gè)新領(lǐng)域,是指直接或間接地對(duì)孕期胎兒情況進(jìn)行檢測(cè),繼而采取一些必要的措施,防止嚴(yán)重遺傳病,先天性畸形和智力障礙患兒的出生,提高人口素質(zhì)。產(chǎn)前診斷是實(shí)現(xiàn)優(yōu)生的重要措施之一。
　　 產(chǎn)前診斷的技術(shù)根據(jù)取材方法不同,分為創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷與非創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷。就現(xiàn)階段而言,創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷仍為臨床應(yīng)用最廣的診斷方法,包括羊膜腔穿刺、絨毛活檢、胎兒臍帶血穿刺及胎兒

2、鏡檢查。其中胎兒臍帶血穿刺獲取純胎血具有其他方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì),為胎兒宮內(nèi)診斷和治療提供了更為廣闊的發(fā)展前途,臨床應(yīng)用廣泛。
　　 純胎血(臍血)在產(chǎn)前診斷、優(yōu)生學(xué)及胎兒生物學(xué)研究中具有廣泛作用,對(duì)胎兒染色體、胎兒血液、免疫及內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病,遺傳代謝缺陷和胎兒感染等疾病有診斷價(jià)值。但是如果由于各種因?yàn)?如胎兒體位、穿刺者技術(shù)差異等)導(dǎo)致誤穿,使標(biāo)本出現(xiàn)母血污染或混入其它非臍血成分,則不能進(jìn)行下一步的各項(xiàng)檢測(cè)。目前,臨床上用于鑒定

3、臍血的方法包括瓊脂糖血紅蛋白電泳法、Kleihaure染色法及抗堿變性試驗(yàn)。上述方法都需要送往相關(guān)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室使用專用儀器和試劑進(jìn)行檢測(cè),費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因而,能否在穿刺術(shù)中快速地對(duì)所采集的樣本進(jìn)行臍血鑒定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 血紅蛋白是一種結(jié)合蛋白,由血紅素和珠蛋白構(gòu)成。血紅素由原卟啉與亞鐵原子組成,每一個(gè)珠蛋白分子有二對(duì)肽鏈,一對(duì)是類α珠蛋白鏈,由141個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,有α、ζ兩種；另一對(duì)是類β鏈,有β、γ、δ、及ε四種。

4、在人體不同發(fā)育階段,血紅蛋白的組成各不相同。胚胎早期先合成ζ鏈和ε鏈,形成Hb Gower I(ζ2ε2),同時(shí)或稍后合成α鏈和γ鏈,形成Hb Gower Ⅱ(α2ε2)和Hb Portland(ζ2γ2)；12周時(shí)ζ鏈和ε鏈逐漸消失,γ鏈迅速增加,β鏈開(kāi)始合成,血紅蛋白以胎兒血紅蛋白(fetalhemoglobin,HbF,α2γ2)為主；妊娠末期和出生以后,γ鏈迅速降低,β鏈迅速增加,血紅蛋白以HbA(α2β2)為主。
　　

5、 臍血管穿刺的最佳時(shí)間為:妊娠20～24周,而在這一時(shí)期,胎兒血中HbF含量很高,約占血紅蛋白總量的90％,HbA僅占5～10％,隨后HbA的合成增加,至出生時(shí)HbA約占30％,HbF約占70％,HbA2<1％。出生后HbF迅速為HbA所代替,1歲時(shí)HbF不超過(guò)5％,至2歲后不超過(guò)2％。
　　 本研究擬開(kāi)發(fā)一種能在臍血管穿刺術(shù)中快速、有效地診斷樣品是否為臍血的HbF膠體金免疫層析快速診斷試條。首先,我們對(duì)胎兒血紅蛋白(HbF)進(jìn)

6、行純化,獲得高純度、具有空間表位的胎兒血紅蛋白抗原分子,用以制備人胎兒血紅蛋白單克隆抗體。篩選、配對(duì)建立反應(yīng)模式,用以制備具有高靈敏度和高精確度的HbF膠體金免疫層析快速診斷試紙條。
　　 設(shè)計(jì)與方法
　　 本研究包括三部分內(nèi)容:(1)胎兒血紅蛋白的提取、純化及免疫活性鑒定；(2)抗胎兒血紅蛋白單克隆抗體的制備及鑒定；(3)膠體金免疫層析法檢測(cè)胎兒血紅蛋白。
　　 第一,首先采用生理鹽水洗滌、四氯化碳萃取得到粗提

7、胎兒血紅蛋白,再經(jīng)sephadexG50凝膠層析柱層析法純化。采用SDS-PAGE電泳鑒定純化后胎兒血紅蛋白純度及Western blot鑒定其免疫活性。第二,用四氯化碳萃取法粗提的胎兒血紅蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行融合,融合細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基作選擇性培養(yǎng)。用純化后的胎兒血紅蛋白(HbF)作抗原,采用間接ELISA法對(duì)融合的雜交瘤克隆進(jìn)行篩選,對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆及時(shí)進(jìn)行亞克隆,對(duì)有意義的細(xì)胞株及早

8、凍存。最后采用小鼠腹腔接種法生產(chǎn)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的腹水,一周后收集腹水并對(duì)腹水中的單克隆抗體的性質(zhì)、效價(jià)、特異性進(jìn)行鑒定。第三,采用proteinG親和層析法和飽和硫酸銨法純化腹水,利用時(shí)間分辨熒光免疫分析法篩選最佳單克隆抗體配伍對(duì),采用雙抗體夾心法建立診斷胎兒血紅蛋白的GICA法(膠體金免疫層析法,Gold-immunochromatography assay)。
　　 結(jié)果與討論
　　 采用生理鹽水洗滌、四氯化碳萃取

9、得到粗提胎兒血紅蛋白,再經(jīng)sephadexG50凝膠層析柱層析法純化,獲得高純度、具有空間表位的胎兒血紅蛋白抗原分子。純化后的胎兒血紅蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定純化蛋白雜帶消失,蛋白單體分子量約為16kDa,與胎兒血紅蛋白單體相對(duì)分子質(zhì)量16kDa基本一致,純度為95％,濃度為800μg/ml。同時(shí)應(yīng)用綿羊抗人胎兒血紅蛋白抗體(此抗體只與HbF反應(yīng),與HbA不反應(yīng))對(duì)純化前和純化后的胎兒血紅蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢查,結(jié)果顯示純化后的胎

10、兒血紅蛋白在約16kDa處呈現(xiàn)出條帶,表明純化后的HbF具有良好的抗原性。
　　 采用間接ELISA法篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株,獲得6株能分泌高效價(jià)和高特異性的抗胎兒血紅蛋白(HbF)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。Westernblot鑒定該單克隆抗體只與胎兒血紅蛋白(HbF)反應(yīng),不與成人血紅蛋白(HbA)反應(yīng),具有高度特異性；Ig類與亞類鑒定結(jié)果均為IgG1；6株單克隆抗體腹水的ELISA效價(jià)為1:8000～1:16000,從而可為

11、胎兒血紅蛋白免疫膠體金快速診斷試紙條的研制提供抗體。
　　 采用proteinG親和層析法和飽和硫酸銨法純化6株單克隆抗體。采用proteinG親和層析法純化后的單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,結(jié)果顯示雜蛋白消失,獲得了較高純度的抗體,分別在約55kDa和25kDa處出現(xiàn)明顯條帶,為單克隆抗體的重鏈和輕鏈；采用飽和硫酸銨法純化后的單克隆抗體經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定,結(jié)果顯示雜蛋白沒(méi)有完全消失,但是腹水中主要的雜蛋白(白蛋

12、白,分子量約66kDa)基本去除,分別在約55kDa和25kDa處也出現(xiàn)較明顯條帶,為單克隆抗體的重鏈和輕鏈。純化后的單克隆抗體利用時(shí)間分辨熒光免疫分析法篩選最佳配伍對(duì),建立診斷胎兒血紅蛋白的GICA法,結(jié)果顯示以5G11包被抗體,5C12標(biāo)記抗體和以5H8為包被抗體,5C12標(biāo)記抗體為GICA較適合的反應(yīng)模式。用制備的膠體金免疫層析試紙條對(duì)胎兒臍血和母血進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示以5G11為包被抗體,5C12為標(biāo)記抗體制成的膠體金免疫層析試紙

13、條對(duì)胎兒純臍血(HbF82.6～87.6％)、母胎混合血(HbF78.8～21.9％)、母血以及血清(HbF=0)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示本研究所研發(fā)的試紙條不僅可以用于快速初步判斷樣本是否符合純臍血或純母血,而且可以鑒別出一定混合比例的母胎混合樣本,達(dá)到了臨床上目前采用的血紅蛋白電泳鑒定法的鑒別水準(zhǔn),而且簡(jiǎn)便快速,只要試紙條沒(méi)有呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng),尤其是出現(xiàn)弱陽(yáng)性或陰性反應(yīng),就說(shuō)明所取樣品一定不是純臍血,需要當(dāng)場(chǎng)重新穿刺。
　　 雖然采