透明顫菌血紅蛋白基因在蘇云金芽胞桿菌中的表達及對其發(fā)酵特性的影響.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌(Bt)在發(fā)酵過程中需要消耗大量氧氣用以維持細胞正常代謝和殺蟲蛋白的合成。透明顫菌血紅蛋白(VHb)是一種來源于原核生物的氧結(jié)合蛋白。本研究將透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)表達于Bt中，通過提高細胞對氧氣的利用能力，達到促進菌體生長和產(chǎn)物合成的目的。 1．本研究構(gòu)建了包含luxS啟動子和vgb基因的整合載體pEG491-vgb<'+>，利用該載體，將vgb基因整合到Bt菌株BMB171的染色體上，構(gòu)建了菌株BMB1

2、71-VHb<'+>。再將攜帶cryIAc10基因的質(zhì)粒pHT304-Kan'-cry轉(zhuǎn)入BMB171VHb<'+>中，得到了菌株BMB667-VHb<'+>。vgb和crylAc10基因在BMB667-vHb<'+>中都得到了表達。同時構(gòu)建了不表達VHb的對照菌株BMB667-VHb<'->。 2．在高、中、低3種供氧條件的發(fā)酵實驗中，BMB667-VHb<'+>的細胞濃度(CFU)分別為對照菌株的0.94，1.23，和1.5

3、9倍；其晶體蛋白(ICP)產(chǎn)量分別為1.22，1.63和3.13倍；BMB667-VHb<'+>的ICP產(chǎn)量最大值出現(xiàn)也比對照菌株提前4-8 h。高、低兩種裝液量搖瓶發(fā)酵中，VHb表達菌株與對照相比，其對棉鈴蟲幼蟲的LC<,50>值分別下降了36.6％和10.0％。 3．在臨界氧濃度(COC)實驗中，臨界氧濃度最高出現(xiàn)在第4 h；第4 h時，BMB667-VHb<'+>的COC為12％，較對照菌株COC18％下降了33％。發(fā)酵過

4、程中，BMB667-VHb<'+>最大攝氧率(OuR)值達到68.6．mmol/Lh；較對照菌株的最大OUR值39.6 mmol/Lh提高73％；BMB667-VHb<'+>的最大呼吸強度(Q)為18.6 mmol/gh與對照的呼吸強度14.8 mmol/gh相比，有20.4％的增長。在相同發(fā)酵條件下，VHb表達菌株和對照菌株分別攝取了通入氧氣量的3.1％和2.2％；VHb的表達菌株比對照菌株多利用了41％的氧氣。BMB667-

5、VHb<'+>和BMB667-VHb<'->的最大比生長速率分別為0.783 h<'-1>和0.801 h<'-1>，葡萄糖半飽和常數(shù)分別為0.272g/L和0.297g/L。 4．本研究結(jié)果表明，vgb在Bt中表達以后，促進了菌數(shù)和晶體產(chǎn)量的增長，產(chǎn)物較菌數(shù)的增長明顯，促進效果隨著供氧條件的降低而增加。與氧代謝有關(guān)的菌株發(fā)酵特性也因vgb的表達而改變，COC、OuR和Q<,O2>都得到提高，這些發(fā)酵特性的改變增強了菌株攝取氧氣