福氏志賀菌新sRNA的識(shí)別及生物學(xué)功能研究.pdf

1、志賀菌(shigella spp.)為革蘭氏陰性菌，是引起細(xì)菌性痢疾的重要病原菌，目前福氏志賀菌的全基因組測(cè)序工作已完成，但還沒有針對(duì)福氏志賀菌系統(tǒng)地開展sRNA的識(shí)別和功能研究工作，因此開展福氏志賀菌sRNA的研究，并發(fā)現(xiàn)具有重要功能的sRNA，將加深對(duì)細(xì)菌致病機(jī)理等方面的理解，同時(shí)也對(duì)藥物研究和疫苗開發(fā)提供新的思路。
　　首先，通過生物信息學(xué)的方法在福氏志賀菌中預(yù)測(cè)sRNA候選基因，根據(jù)sRNA高度保守性的特點(diǎn)，利用生物信息學(xué)

2、的轉(zhuǎn)錄單元預(yù)測(cè)方法，通過尋找基因間區(qū)的啟動(dòng)子或是終止子來預(yù)測(cè)新的sRNA，最后成功地在福氏志賀菌2a301株中預(yù)測(cè)得到了57條候選sRNA。然后對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)到的sRNA進(jìn)行驗(yàn)證，RT-PCR和Northern blot實(shí)驗(yàn)最后確定新發(fā)現(xiàn)4條sRNA，分別命名為Ssr1、Ssr9、Ssr44和Ssr54。通過RACE實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了這4條sRNA的轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)，并獲得它們的全長序列信息。
　　為研究新發(fā)現(xiàn)的sRNA在福氏志

3、賀菌所發(fā)揮的生物學(xué)功能，采用λ-RED同源重組的方法成功地構(gòu)建了Ssr1和Ssr54的2條sRNA的突變株。首先，研究sRNA對(duì)福氏志賀菌在不同環(huán)境壓力下生長狀態(tài)的影響，將野生株、Ssr1和Ssr54突變株及其回復(fù)株置于不同環(huán)境壓力培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h并繪制生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ssr1缺失后在pH5.0的酸性壓力下生長速度與野生株相比較為緩慢，Ssr54缺失后在高滲透壓環(huán)境壓力下生長速度與野生株相比明顯加快。為研究sRNA在福氏志賀菌響應(yīng)

4、不同環(huán)境壓力方面的功能，利用qRT-PCR方法檢測(cè)Ssr1和Ssr54在不同環(huán)境壓力下表達(dá)水平的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ssr1的表達(dá)水平在pH2.0、pH2.5、pH3.0、pH3.5和pH4.0的酸性環(huán)境中相對(duì)于pH7.0顯著升高，并且隨著pH值的升高Ssr1的表達(dá)逐漸降低，Ssr54在pH5.5、pH6.0、pH6.5、低滲透壓、營養(yǎng)缺乏和氧化應(yīng)激環(huán)境壓力下的表達(dá)水平均有明顯升高，說明Ssr1和Ssr54通過響應(yīng)不同環(huán)境壓力信號(hào)中來發(fā)揮生

5、物學(xué)功能。對(duì)比野生株與Ssr1和Ssr54突變株在不同環(huán)境壓力刺激一定時(shí)間后的生存率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ssr1缺失后在酸性培養(yǎng)條件下生存率下降了22％，Ssr54缺失后在氧化應(yīng)激壓力下生存率升高了30％，說明Ssr1和Ssr54在影響了福氏志賀菌耐受環(huán)境壓力的能力。通過以上研究發(fā)現(xiàn)，Ssr1和Ssr54通過響應(yīng)外界環(huán)境壓力信號(hào)，進(jìn)而改變自身的表達(dá)量，從而增強(qiáng)適應(yīng)環(huán)境的能力。為了研究Ssr1和Ssr54是否在福氏志賀菌的致病方面發(fā)揮的功能，開展了

6、豚鼠角膜結(jié)膜炎實(shí)驗(yàn)和小鼠肺競(jìng)爭(zhēng)性侵襲等毒力實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，Ssr1缺失后導(dǎo)致豚鼠角膜結(jié)膜炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，小鼠肺侵襲能力增強(qiáng)，這說明Ssr1的缺失使福氏志賀菌的毒力增強(qiáng);而Ssr54缺失后豚鼠角膜結(jié)膜炎癥反應(yīng)減弱，小鼠肺侵襲能力下降，說明Ssr54的缺失使福氏志賀菌的毒力減弱，以上結(jié)果說明Ssr1和Ssr54均參與了福氏志賀菌毒力功能的調(diào)控。為了進(jìn)一步探索Ssr1和Ssr54在機(jī)體免疫應(yīng)答中的功能，對(duì)野生株和兩條sRNA突變株感染過程中宿主

7、產(chǎn)生的細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)分析，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ。結(jié)果顯示Ssr1突變株感染小鼠24h后，與野生株相比，IL-1β的表達(dá)顯著升高;感染48h后，與野生株相比，TNF-α的表達(dá)顯著升高，說明Ssr1突變株感染早期Ssr1突變株可誘導(dǎo)TNF-α和IL-1β表達(dá)水平升高，使炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，與豚鼠角膜結(jié)膜炎的結(jié)果一致。Ssr54突變株感染小鼠后，與野生株細(xì)胞因子表達(dá)水平與野生株相比無明顯差異。
　　為了深入研究S

8、sr1和Ssr54發(fā)揮生物學(xué)功能的具體作用機(jī)制，進(jìn)一步利用雙向電泳尋找Ssr1和Ssr54潛在的靶標(biāo)。經(jīng)質(zhì)譜分析Ssr1缺失共有51個(gè)蛋白差異點(diǎn)，其中27個(gè)下調(diào)蛋白，24個(gè)上調(diào)蛋白;Ssr54缺失共發(fā)現(xiàn)40個(gè)差異蛋白，其中25個(gè)下調(diào)蛋白，15個(gè)上調(diào)蛋白。對(duì)Ssr1和Ssr54缺失后表現(xiàn)出明顯差異且具有重要意義的蛋白進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證，即在轉(zhuǎn)錄水平上驗(yàn)證相應(yīng)蛋白編碼基因表達(dá)量的相應(yīng)變化，包括Ssr1缺失后dnak，ipaA，mxiC

9、，ipgC和ipaD的表達(dá)，以及Ssr54缺失后tolC，hns，treF和ompA的表達(dá)，結(jié)果與雙向電泳結(jié)果一致。福氏志賀菌Ssr1通過響應(yīng)酸性環(huán)境壓力信號(hào)，可能通過上調(diào)dnak的表達(dá)基因來提高福氏志賀菌耐受酸性環(huán)境壓力影壓力信號(hào)，上調(diào)dnaK基因的表達(dá)提高耐受酸性環(huán)境壓力的功能的能力，并通過下調(diào)影響T3SS中的ipaA，mxiC，ipgC和ipaD基因的表達(dá)來降低引起福氏志賀菌的毒力功能的降低;Ssr54可能通過響應(yīng)滲透壓等環(huán)境壓力

10、信號(hào)，下調(diào)treF降低耐受高滲壓力能力，并通過上調(diào)tolC和hns基因的表達(dá)來提高福氏志賀菌的毒力功能。sRNA發(fā)揮功能的機(jī)制可能是直接與靶標(biāo)mRNA結(jié)合，或者間接調(diào)節(jié)靶標(biāo)mRNA的表達(dá)，大多數(shù)sRNA需要Hfq蛋白的結(jié)合來調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮一定的生物學(xué)功能，為了揭示新發(fā)現(xiàn)的sRNA是否依賴Hfq來發(fā)揮功能，首先開展福氏志賀菌中Hfq的具體功能的研究。
　　細(xì)菌中的Hfq蛋白（host factor for RNA pha

11、ge Qβ）是一類高度保守的RNA結(jié)合蛋白，主要的生物學(xué)功能是通過結(jié)合并幫助sRNA與靶標(biāo)mRNA結(jié)合來影響靶標(biāo)基因的表達(dá)。已有研究表明Hfq在細(xì)菌中發(fā)揮多種生物學(xué)功能，包括環(huán)境壓力適應(yīng)、耐受環(huán)境壓力、毒力等等。因此深入研究福氏志賀菌中Hfq的功能及調(diào)控機(jī)制，將有助于對(duì)福氏志賀菌sRNA致病機(jī)制的深入研究。
　　首先利用λ-RED同源重組的方法成功地構(gòu)建了福氏志賀菌的hfq突變株。將hfq克隆到pACU184低拷貝質(zhì)粒中再轉(zhuǎn)入hf

12、q突變株的方法構(gòu)建了hfq回復(fù)株，并通過PCR的方法驗(yàn)證證明構(gòu)建成功。hfq突變株和回復(fù)株的構(gòu)建為福氏志賀菌中hfq的功能研究奠定了基礎(chǔ)。hfq的缺失對(duì)福氏志賀菌生存及生長狀態(tài)影響做了生長曲線分析，結(jié)果顯示，與野生株相比，hfq突變株在正常條件下進(jìn)入平臺(tái)期后生長速度明顯下降，在酸性環(huán)境壓力下生長速度在對(duì)數(shù)生長期較野生株明顯減慢。為研究hfq對(duì)福氏志賀菌不同環(huán)境壓力下生存能力的影響，進(jìn)行了野生株和hfq突變株在不同生存環(huán)境壓力的生存率實(shí)驗(yàn)

13、，在高滲透壓、酸性及氧化應(yīng)激刺激下，hfq突變株的生存率均較野生株有明顯的降低，降低的幅度在30％-60％之間，說明hfq在福氏志賀菌耐受環(huán)境壓力中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。為了研究hfq能否有效地響應(yīng)環(huán)境壓力，利用qRT-PCR檢測(cè)了hfq在福氏志賀菌應(yīng)對(duì)不同環(huán)境壓力下的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hfq在酸性和氧化應(yīng)激壓力下表達(dá)水平顯著升高，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在不同pH環(huán)境下耐酸相關(guān)基因(gadB，gadA，hdeB，hdeA和hdeD)及毒力相關(guān)基因（i

14、paA，ipaB，ipaJ, ipaH4.5，ipaH9.8，ipaH1.4，ipaH7.8，ipaH2.5，ipgD，ipgH，mxiC，mxiI，mxiM，spa13，spa15，spa33，spaP和spa9）的表達(dá)與hfq的表達(dá)具有顯著正相關(guān)性，并且均在pH2.0-4.0的環(huán)境壓力下表達(dá)水平最高，說明hfq能夠有效地響應(yīng)酸性和氧化應(yīng)激壓力信號(hào)。小鼠肺侵襲和HeLa細(xì)胞侵襲等毒力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，hfq缺失后福氏志賀菌的侵襲力明顯下

15、降，說明hfq對(duì)福氏志賀菌的毒力功能有一定影響。檢測(cè)野生株和hfq突變株感染小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ細(xì)胞因子產(chǎn)生的水平變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)感染24h后，hfq突變株感染的肺泡灌洗液中TNF-α表達(dá)與野生株相比明顯降低，炎癥反應(yīng)減弱，與豚鼠角膜結(jié)膜炎表現(xiàn)的結(jié)果一致，說明hfq缺失后影響了福氏志賀菌引起的機(jī)體免疫應(yīng)答的改變，細(xì)胞因子分泌下降炎癥反應(yīng)減弱。為研究hfq發(fā)揮適應(yīng)環(huán)境壓力和毒力方面的作用機(jī)制，利用qR

16、T-PCR檢測(cè)了T3SS相關(guān)基因和耐酸相關(guān)基因在hfq突變株和野生株中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)hfq突變株中T3SS相關(guān)基因基本不表達(dá)，耐酸相關(guān)基因的表達(dá)與野生株相比也明顯降低。以上結(jié)果說明，hfq通過響應(yīng)酸環(huán)境壓力信號(hào)，上調(diào)耐酸相關(guān)基因來提高福氏志賀菌耐受酸環(huán)境壓力能力，上調(diào)T3SS相關(guān)基因來影響福氏志賀菌的毒力輸出的提高。本研究中新發(fā)現(xiàn)的Ssr1和Ssr54均參與福氏志賀菌適應(yīng)環(huán)境壓力和毒力的調(diào)控過程，在hfq相關(guān)研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的功

17、能調(diào)控，特別是Ss1和hfq均參與了T3SS的調(diào)控，目前，正在開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證Ssr1是否與Hfq蛋白結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)功能。此外，首次報(bào)道了我國新出現(xiàn)的福氏志賀氏菌1c亞型，并對(duì)其進(jìn)行了多位點(diǎn)序列分型分析和耐藥性研究，同時(shí)首次發(fā)現(xiàn)我國的1c型福氏志賀菌對(duì)喹諾酮和頭孢類抗生素耐藥性。
　　綜上所述，本研究結(jié)合生物信息學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法在福氏志賀菌中新發(fā)現(xiàn)了4條sRNA。對(duì)福氏志賀菌新發(fā)現(xiàn)兩條sRNA和Hfq功能研究中發(fā)現(xiàn)，它們通過