人源福氏志賀菌對雞腸上皮細胞侵襲特性及其機制研究.pdf

1、眾多研究報道指出，志賀菌的宿主為人和非人靈長類動物。近些年，國內(nèi)外有志賀菌感染實驗猴、家兔、犢牛和仔豬的臨床報道。許蘭菊、王川慶等于2004年首次報道了雞志賀菌病例，主要以雛雞膿血痢為特征。對中國部分地區(qū)有腹瀉病史的雞群進行血清流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，志賀菌抗體陽性率達28.3％～33.7％，說明雞志賀菌感染已成為中國雞群腹瀉疾病的重要病因之一。病原學研究發(fā)現(xiàn)，雞源志賀菌在生物學及血清學特性等方面與人源志賀菌完全相同。從基因水平上看，雞源志賀

2、菌與人源志賀菌高度同源，可能起源于人源志賀菌，或是人源志賀菌新的亞種。在交互感染方面，以人源鮑氏志賀菌、人源福氏志賀菌進行雛雞感染試驗，組織免疫組化和電鏡結(jié)果檢測人源志賀菌能侵入雞腸道上皮細胞，證明人源志賀菌能感染雞，且人源福氏志賀菌致病性最強。這一發(fā)現(xiàn)預示著公共衛(wèi)生和人類健康又面臨新的挑戰(zhàn)。
　　為研究人源志賀菌對雞致病性和相關(guān)侵襲特性提供體外模型，本研究建立了雞腸上皮原代細胞分離培養(yǎng)方法。分別取不同日齡雞胚，采用0.1 g/L

3、Ⅰ型中性蛋白酶和300U/mLⅪ型膠原酶聯(lián)合分離純化雞腸上皮原代細胞，篩選雞腸上皮原代細胞最佳培養(yǎng)方法，并對培養(yǎng)細胞進行鑒定。然后采用0.125％胰酶和0.01％EDTA聯(lián)合消化進行雞腸上皮原代細胞傳代。應用Ⅰ型中性蛋白酶和Ⅺ型膠原酶消化15日齡雞胚腸組織可獲得滿意的腸上皮細胞分離效果，細胞貼壁性良好。培養(yǎng)出圓形或多角形單層生長呈“鋪路石樣”的細胞，培養(yǎng)的細胞在12h內(nèi)貼壁生長，24-48h明顯增殖，72h后細胞增殖速度減慢，生長狀況不

4、良。經(jīng)透射電鏡觀察鑒定為腸上皮細胞。且傳代后細胞貼壁生長良好。制備的細胞可以連續(xù)傳代3代。建立雞腸上皮原代細胞分離培養(yǎng)方法，可獲得純度較高的雞腸上皮原代細胞。
　　為進一步驗證人源志賀菌對雞的致病性并建立體外研究模型,采用Hela細胞慶大霉素保護試驗和免疫組織化學染色檢測分離的人源福氏志賀菌ZD02株的侵襲毒力。然后采用細胞免疫組織化學染色研究ZD02株對雞腸上皮細胞的侵襲力和相關(guān)侵襲特性。人源福氏志賀菌ZD02株能夠侵入Hela

5、細胞，慶大霉素保護試驗結(jié)果顯示，感染后30、60、90、120 min時ZD02株侵襲率分別為1.43％、2.43％、2.56％、2.62％，證明ZD02株具有侵襲毒力。ZD02株侵襲雞腸上皮原代細胞免疫組織化學檢測結(jié)果顯示，ZD02株能侵入雞腸上皮細胞，感染后1、2、3、4h時ZD02株侵襲率分別為1.7％、6.2％、8.0％、11.2％。雞腸上皮原代細胞經(jīng)EGTA處理后，ZD02株侵襲率顯著提高。結(jié)果證明人源福氏志賀菌ZD02株對雞

6、腸上皮細胞具有侵襲力，且從腸上皮細胞基底側(cè)部侵襲。本研究進一步證明人源志賀菌對雞腸上皮細胞的侵襲力，具有人禽互傳的可能性，雞腸上皮原代細胞可作為研究志賀菌致病機理的體外模型。
　　為研究細胞信號轉(zhuǎn)導和骨架在人源福氏志賀菌侵襲雞腸上皮細胞中的作用。分別用酪氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白磷酸酶、蛋白激酶C、Ca2+通道等信號轉(zhuǎn)導抑制劑染料木黃酮、原釩酸鈉、星狀孢子素、硝苯地平和微絲蛋白聚合抑制劑細胞松弛素B處理雞腸上皮原代細胞后，采用細胞免

7、疫組織化學染色檢測人源福氏志賀菌ZD02株對雞腸上皮原代細胞侵襲率，用間接免疫熒光雙重標記檢測ZD02株侵襲雞腸上皮原代細胞后F-肌動蛋白分布的變化。染料木黃酮、硝苯地平和細胞松弛素B能顯著抑制人源福氏志賀菌ZD02株內(nèi)化，星狀孢子素和原釩酸鈉對ZD02株的內(nèi)化無影響，人源福氏志賀菌侵襲雞腸上皮原代細胞時F-肌動蛋白發(fā)生聚集。人源福氏志賀菌ZD02株侵襲雞腸上皮原代細胞過程中需要酪氨酸蛋白激酶、Ca2+通道活化以及細胞微絲重排。