腸急性損傷條件下腸上皮間淋巴細胞對腸上皮細胞作用及機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　腸黏膜屏障是機體抵御腸腔病原體入侵的重要屏障。研究表明:缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）、應(yīng)激、放射性損傷等急性病理刺激下，均會發(fā)生腸黏膜屏障功能受損，導(dǎo)致腸源性感染，加重原發(fā)疾病，最終引起多器官功能衰竭。盡管目前針對腸黏膜屏障損傷與保護等領(lǐng)域做了大量研究工作，但腸黏膜屏障中涉及免疫調(diào)控與免疫反應(yīng)的機制仍未闡明。針對當前腸黏膜屏障急性損傷后繼發(fā)的免疫功能紊亂甚至免疫反應(yīng)介導(dǎo)的“二次損

2、傷”等復(fù)雜問題，迫切要求我們闡明腸黏膜免疫功能紊亂及調(diào)節(jié)的關(guān)鍵機制，為急性病理條件下腸黏膜屏障保護提供新策略。
　　作為腸黏膜免疫系統(tǒng)的重要一員，腸上皮間淋巴細胞(Intraepithelial lymphocyte，IELs)是定植于腸上皮細胞間的一類獨特的淋巴細胞群。IELs由多種亞群構(gòu)成，主要包括TCRγδ+T細胞、TCRαβ+T細胞。TCRαβ+IELs又可分為TCRαβ+CD8αα+IELs、TCRαβ+CD8αβ+IE

3、Ls和TCRαβ+CD4+IELs三個亞群;TCRγδ+幾乎全部為CD8αα+。IELs的多亞群構(gòu)成，也提示了它們來源的多樣性。因此，IELs來源多樣，功能復(fù)雜，已成為近年來腸道免疫研究的熱點。在生理情況下，IELs分泌細胞因子（如KGF）、抗菌肽等，維持上皮細胞生長及抵御病原體入侵;病理情況下，IELs能快速做出應(yīng)答，從半活化狀態(tài)迅速進入活化狀態(tài)，分泌細胞因子參與炎癥反應(yīng)，同時這些細胞因子也可能介導(dǎo)對腸黏膜的損傷，導(dǎo)致屏障功能下降。<

4、br>　　前期研究發(fā)現(xiàn)，小腸I/R可以直接損傷腸上皮細胞以及細胞間連接。例如:腸黏膜絨毛的明顯斷裂、脫落和腸道上皮細胞的凋亡增加、壞死;維持IELs在上皮細胞間定植的緊密連接蛋白（Claudin-1和Occludin）結(jié)構(gòu)破壞;腸黏膜通透性增加。我們在病人缺血的腸道標本中發(fā)現(xiàn)，IL-7表達增多。IL-7作為腸上皮細胞分泌的、刺激淋巴細胞發(fā)育的細胞因子，在維持IELs表型和功能方面發(fā)揮了重要作用。在我們課題組前期構(gòu)建的IL-7腸道過表達小

5、鼠中發(fā)現(xiàn)，IELs表現(xiàn)為Th1型細胞因子分泌增多，活化標志CD69+表達上調(diào)。提示:IL-7的上調(diào)，介導(dǎo)淋巴細胞過度活化，參與炎癥反應(yīng)。IELs無論空間距離和功能調(diào)控都與腸上皮細胞有著緊密聯(lián)系。因此，我們推測I/R可導(dǎo)致IELs的過度活化，同時，活化后的IELs介導(dǎo)了對腸黏膜屏障的損傷。我們在本論文中重點探討小腸I/R條件下IELs的功能變化，以及其對上皮屏障產(chǎn)生的影響。同時，我們也注意到，急性放射性損傷可以導(dǎo)致上皮細胞大量死亡，由上皮

6、細胞分泌的IL-7是否會受到影響。那么，這種情況下，IELs又將發(fā)生什么變化呢？我們針對這一問題也將進行初步的探討。
　　因此本研究運用流式細胞分選，IELs上清與上皮細胞共培養(yǎng)、免疫組化、蛋白印跡、ELISA等技術(shù)，探討I/R和急性放射性損傷條件下（以I/R為重點），IELs亞型及功能的變化規(guī)律，以及IELs功能改變后對腸黏膜屏障損傷的相關(guān)機制。其中包括:明確對上皮屏障造成損傷的IELs源性細胞因子，該細胞因子對緊密連接蛋白如C

7、laudin-1、Occludin等的表達及結(jié)構(gòu)變化情況;并通過檢測跨上皮電阻抗(TER)，確定IELs對屏障功能的調(diào)控作用;最后人為干預(yù)該細胞因子，評估腸屏障損傷的改善情況。為進一步闡明腸急性損傷條件下IELs的變化規(guī)律及其調(diào)控腸黏膜屏障的作用機制提供理論依據(jù)，為腸黏膜屏障損傷干預(yù)提供新靶點。
　　方法:
　　建立小鼠急性小腸I/R模型及急性放射性損傷模型，運用HE染色，免疫組化，Ussing Chamer，Western

8、 Blot等技術(shù)了解急性損傷情況下腸黏膜的改變情況。
　　圍繞腸I/R模型，運用流式細胞技術(shù)、免疫組化、定量PCR技術(shù)，闡明I/R條件下IELs表型和功能變化規(guī)律。
　　運用流式細胞分選IELs，結(jié)合IELs上清與上皮細胞共培養(yǎng)模型，明確IELs源性細胞因子TNF-α對上皮細胞的作用，以及細胞因子對上皮間緊密連接蛋白表達及結(jié)構(gòu)的影響。
　　使用抗TNF-α抗體術(shù)前干預(yù)，通過跨上皮電阻抗(TER)及組織損傷評分的技術(shù)手段

9、，明確IELs源細胞因子在腸黏膜屏障損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果:
　　腸I/R條件下，小腸黏膜正常結(jié)構(gòu)受損，絨毛斷裂，上皮下間隙增大，上皮脫落，固有層細胞成分增多，腸黏膜通透性增大。
　　腸I/R后腸黏膜緊密連接蛋白(Claudin-1，Occludin)表達下降，Occludin在上皮細胞頂端正常結(jié)構(gòu)遭到破壞。急性腸I/R對IELs數(shù)量沒有影響，但導(dǎo)致IELs與上皮細胞的正常連接消失。
　　腸I/R條件下

10、，上皮細胞分泌IL-7增多，IELs亞群CD8αβ+，CD4+和TCRαβ+的百分比增高，CD8+，CD4+IELs凋亡先后開始啟動。并且CD8+，CD4+IELs活化顯著增加，TNF-α、IL-10 mRNA拷貝數(shù)增多，KGF減少，IFN-γ沒有明顯變化。
　　I/R處理后的IELs上清與上皮細胞共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)上皮細胞Claudin-1、Occludin表達下降，Occludin結(jié)構(gòu)完整性破壞，上皮屏障通透性增高，在I/R處理后

11、的IELs上清中加入TNF-α抗體，可以逆轉(zhuǎn)上述改變。
　　I/R處理后，CD45+IELs胞內(nèi)合成以及分泌的TNF-α增多，用IL-7刺激體外培養(yǎng)的IELs后，TNF-α分泌明顯增多?？筎NF-α治療可以顯著緩解I/R小鼠腸黏膜損傷。
　　急性放射性腸損傷直接導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞嚴重，絨毛形態(tài)不能正常維持，凋亡細胞增多，腸道IL-7表達降低，腸道IELs細胞數(shù)量72h后減少非常明顯。給予外源性IL-7處理，急性放射性腸損傷導(dǎo)

12、致的IELs數(shù)量降低得到改善。
　　結(jié)論:
　　急性I/R條件下:IELs受到影響，表現(xiàn)為與上皮細胞間連接結(jié)構(gòu)破壞，IELs亞群比例失調(diào);IELs活化增加，其分泌的TNF-α介導(dǎo)了對上皮細胞的損傷以及上皮間緊密連接蛋白正常結(jié)構(gòu)的破壞。抗TNF-α治療可以顯著改善腸黏膜損傷。
　　急性放射性腸損傷條件下:腸黏膜結(jié)構(gòu)嚴重破壞，絨毛形態(tài)不能維持，凋亡細胞增多，腸道上皮表達IL-7降低是IELs細胞數(shù)量減少的重要因素之一，給予