脂多糖和維生素D對雞腸上皮細(xì)胞β-防御素表達(dá)的影響.pdf

1、抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是先天免疫反應(yīng)的效應(yīng)分子，其在保護(hù)機(jī)體免受病原菌威脅的過程中作用顯著。AMPs具有廣譜的抗細(xì)菌、真菌、病毒以及支原體活性，其表達(dá)分為固定表達(dá)和誘導(dǎo)表達(dá)且受免疫應(yīng)激類因子和營養(yǎng)因子類調(diào)控，如脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）和維生素D。家禽主要包含兩大類AMPs分子，即β-防御素和cathelicidins，其中β-防御素14種、cathelicidins

2、4種。在人、小鼠以及牛等哺乳動物的研究中發(fā)現(xiàn)維生素D對AMPs有調(diào)控作用，提示可通過營養(yǎng)因素提高機(jī)體β-防御素的表達(dá)從而提高機(jī)體對外界病原的抵抗力進(jìn)而達(dá)到減少抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用的目的。家禽中是否存在這種調(diào)節(jié)機(jī)制尚未見報道。腸道在擔(dān)負(fù)消化和吸收功能的同時還具有免疫功能，是研究維生素D在免疫應(yīng)激條件下對其β-防御素基因表達(dá)的影響的理想模型。
　　本研究中我們優(yōu)化了雞腸上皮原代細(xì)胞分離、培養(yǎng)的條件。結(jié)果表明:15日齡的雞胚的腸道組

3、織更適用于腸上皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng);采用多次少時的消化策略得到的健全的腸隱窩集團(tuán)更多、活力更強(qiáng)，對雞胚的利用率大大提高;采用細(xì)胞篩區(qū)分隱窩和單個細(xì)胞從而對腸上皮細(xì)胞進(jìn)行純化所耗時間大為減少、純度更高，純度可達(dá)到85％以上;腸上皮原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h-48 h進(jìn)入對數(shù)增長期，72 h后細(xì)胞界限模糊，開始出現(xiàn)凋亡。
　　設(shè)置不同濃度的LPS(0、50、100、200、400、800μg/mL)和維生素D(00.2、2、20、200 ng

4、/mL)處理對數(shù)生長期的腸上皮原代細(xì)胞。結(jié)果表明:低濃度的LPS不能引起腸上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)，800μg/mL的LPS能顯著提高TLR4、IL-1和IL-6的表達(dá)，即選取800μg/mL的LPS處理作為激活雞腸上皮細(xì)胞免疫反應(yīng)的有效濃度;單獨(dú)添加維生素D對腸上皮細(xì)胞表達(dá)VDR、IL-1和IL-6的表達(dá)無顯著作用，但在添加LPS的基礎(chǔ)上，其能顯著提高VDR的表達(dá)、顯著降低IL-1和IL-6的表達(dá)，表明維生素D能抑制由LPS引起的炎性反應(yīng)，

5、且這種抑制作用隨維生素D的濃度升高而加強(qiáng)。綜合考慮，選取20μg/mL為維生素D的處理濃度。
　　以篩選的LPS濃度和VD濃度處理雞腸上皮原代細(xì)胞。結(jié)果表明，LPS能顯著提高GAL-1、GAL-3、GAL-4、GAL-5、GAL-6、GAL-9、GAL-10、GAL-12和GAL-13的表達(dá);維生素D能顯著提高GAL-3、GAL-4、GAL-5、GAL-6和GAL-9的表達(dá)，但這種作用僅在免疫應(yīng)激條件下才有所體現(xiàn);對14種雞β-防