萊氏野村菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建.pdf

1、夜蛾科昆蟲包含有一些重要的農(nóng)業(yè)害蟲。重要蟲生真菌萊氏野村菌Nomuraearileyi(Farl.) Samson是該科昆蟲較?；牟≡婢谔镩g有時能在夜蛾種群中形成流行病，對于抑制蟲口的大發(fā)生起著重要作用。和其它昆蟲病原真菌一樣，該菌也存在著致病時間較長、對環(huán)境條件要求較高等缺點，使其真菌殺蟲劑的應(yīng)用受到限制。利用基因工程技術(shù)提高菌株毒力，是克服這些缺點的重要途徑。因此通過基因改造獲得適合市場需要的真菌殺蟲劑具有重要的應(yīng)用價值。幾

2、丁質(zhì)酶是蟲生真菌侵染過程中產(chǎn)生的重要水解酶，可以降解昆蟲體壁中含有幾丁質(zhì)的組分，有利于克服體壁的物理和化學屏障作用，降低昆蟲對病原真菌的防御能力，以達到加快侵染過程和提高致病能力的目的。蝎毒素是神經(jīng)多肽毒素，對昆蟲的毒力強，且具有特異性和高度選擇性，而且編碼基因較小，便于分子操作，是研究蛋白質(zhì)工程、神經(jīng)生物學、免疫學和離子通道等的理想材料。本實驗以兩個分離自夜蛾科昆蟲的萊氏野村菌菌株Nr03和Nr09作為出發(fā)菌株，分別引入外源基因球孢白

3、僵菌幾丁質(zhì)酶基因bbchit1和北非蝎(Androctonus australis)昆蟲特異性神經(jīng)毒素多肽基因aait，分別構(gòu)建含有不同外源基因的兩個一價轉(zhuǎn)基因工程菌株。
　　 實驗首先構(gòu)建了含有篩選標記和目的基因的質(zhì)粒載體pbarGPE1-aait，再以該質(zhì)粒為中間載體，擴增出含有強啟動子、終止子及aait基因的GpdA-aait-TrpC基因片段，將其插入pRNA-hygro-U6.1質(zhì)粒中，構(gòu)建成一個含有篩選標記hygro

4、基因和aait基因的新質(zhì)粒pRNA-hygro-U6.1-aait。通過對萊氏野村菌分生孢子的抑制性實驗，篩選出兩種藥物對萊氏野村菌的最佳抑制濃度，其中潮霉素B的最佳抑制濃度為80μg/ml，苯菌靈的最佳抑制濃度為2μg/ml。采用芽生孢子遺傳轉(zhuǎn)化方法對萊氏野村菌Nr03進行遺傳改造，獲得了一價轉(zhuǎn)蝎毒基因工程菌株Nr03-A。采用同樣方法，利用實驗室保存的含有白僵菌幾丁質(zhì)酶基因的載體pbenGPS3-bbchitl對Nr09菌株進行遺傳