農(nóng)桿菌介導的香菇遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建.pdf

1、香菇(Lentinula edodes)是廣泛種植的食用菌之一，隨著其基因組測序的完成，功能基因組學研究將逐漸展開。遺傳轉(zhuǎn)化體系是基因功能研究的基礎(chǔ)，其中農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化方法有著插入拷貝數(shù)少、穩(wěn)定高效等優(yōu)點。本研究采用農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法構(gòu)建了一套適用于香菇的遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　　 首先從香菇菌株武香1號(W1)中克隆得到gpd啟動子，以質(zhì)粒pCAMBIA1301為骨架，替換掉HYG基因前的啟動子CaMV35S，構(gòu)建了一個新的轉(zhuǎn)化載體

2、pCAMBIA1301-gpd。再將載體pCAMBIA1301-gpd和pCAMBIA1301分別導入農(nóng)桿菌EHA105，在乙酰丁香酮(AS)存在的條件下，農(nóng)桿菌EHA105與香菇菌株W1和L205菌絲體分別共培養(yǎng)3d。經(jīng)ddH2O清洗香菇菌絲后，在含有潮霉素和抗生素的平皿上篩選轉(zhuǎn)化子，PCR檢測排除假陽性干擾。轉(zhuǎn)化子在麥芽浸膏培養(yǎng)基(MYG)上繼代培養(yǎng)5輪后，仍能在含潮霉素的平皿上穩(wěn)定生長。
　　 不同啟動子對不同受體菌株的潮

3、霉素篩選效率統(tǒng)計顯示，當載體pCAMBIA1301-gpd轉(zhuǎn)化香菇菌株W1時，潮霉素篩選效率最高，達到30%左右。其中啟動子為gpd時的潮霉素篩選效率是啟動子為CaMV35S時的兩倍，由此說明，組成型內(nèi)源啟動子對香菇表達外源基因有很強的啟動作用。受體菌株W1的潮霉素篩選效率要略高于菌株L205，這可能與受體菌株的遺傳背景有關(guān)。
　　 本試驗還對共培養(yǎng)的條件進行了優(yōu)化，從農(nóng)桿菌侵染時間、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時間，以及在共培養(yǎng)過程中是

4、否需要添加乙酰丁香酮等4個方面展開。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌侵染10 min、20 min、30 min對潮霉素篩選效率的影響并不明顯，共培養(yǎng)最適溫度為25℃，共培養(yǎng)3d和4d的潮霉素篩選效率差別不大，而共培養(yǎng)2d則不能很好的完成轉(zhuǎn)化；共培養(yǎng)期間添加乙酰丁香酮，對轉(zhuǎn)化子的生長十分必要。
　　 本試驗構(gòu)建的香菇遺傳轉(zhuǎn)化體系，為今后香菇基因重組、基因沉默、基因超量表達、插入突變等基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)，也為香菇生長發(fā)育機制研究提供了重要的