根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橘青霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、背景:
　　 橘青霉(Penicillium citrinum)屬于子囊菌亞門(mén),不整囊菌綱,散囊菌目,散囊菌科,青霉屬,是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌株。美伐他汀(mevastatin)是橘青霉產(chǎn)生的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物,這種聚酮類(lèi)化合物是甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑,通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合HMG-CoA還原酶有效抑制膽固醇的生物合成。美伐他汀經(jīng)過(guò)生物轉(zhuǎn)化后生產(chǎn)的他汀類(lèi)藥物是臨床治療高膽固醇血癥的首選藥物。研究美伐他汀生物合成機(jī)制

2、和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有助于定向改造目的菌株,而這些研究首先需要建立一套穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化方法。目前,常用的絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化方法有:CaCl2-PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電擊轉(zhuǎn)化法、醋酸鋰轉(zhuǎn)化法、基因槍轉(zhuǎn)化法和限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法等。由于絲狀真菌的復(fù)雜性,其遺傳轉(zhuǎn)化體系有別于植物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和原核生物,因此至今仍有許多種類(lèi)的絲狀真菌未能建立合適的遺傳轉(zhuǎn)化體系,以至無(wú)法進(jìn)行深入研究。根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的絲狀真菌轉(zhuǎn)化(Agrobactirium t

3、umfacience mediated-transformant)由于具有轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)便、受體廣泛、單拷貝插入和遺傳穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)在很多絲狀真菌中得到應(yīng)用,但在橘青霉中的應(yīng)用尚未有報(bào)道。因此我們選擇根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法來(lái)構(gòu)建橘青霉遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　　 目的:
　　 本文旨在建立一套能夠在橘青霉中實(shí)現(xiàn)高效穩(wěn)定運(yùn)行的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng),為實(shí)驗(yàn)室橘青霉的美伐他汀生物合成機(jī)制和全局性調(diào)控研究奠定方法基礎(chǔ)。
　　 方法:

4、>　　 1、利用重組DNA技術(shù)構(gòu)建含Pci-laeA的重組質(zhì)粒載體,探討抗生素選擇、孢子濃度、根癌農(nóng)桿菌種類(lèi)、根癌農(nóng)桿菌濃度、乙酰丁香酮濃度、共培養(yǎng)溫度、共培養(yǎng)時(shí)間以及共培養(yǎng)方式等因素對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的橘青霉遺傳轉(zhuǎn)化的影響,篩選優(yōu)化出合適的轉(zhuǎn)化條件。
　　 2、通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增橘青霉基因組中增潮霉素B抗性標(biāo)記基因(Hygromyem Bresistence gene)篩選驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,并在無(wú)潮霉素B(Hygromycin

5、B)篩選壓力的平板上連續(xù)傳代考察其遺傳穩(wěn)定性。
　　 3、對(duì)穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表型觀察,并利用HPLC方法測(cè)定發(fā)酵液中美伐他汀生物合成量。
　　 結(jié)果:
　　 1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示使用50μg/ml的潮霉素B能夠篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子,500μg/ml的頭孢噻肟鈉可以有效清除殘余根癌農(nóng)桿菌。孢子濃度以107個(gè)/ml為佳;農(nóng)桿菌LBA4404的轉(zhuǎn)化效率略高于EHA105,采用濃度為OD600≈0.8左右的根癌農(nóng)桿菌效率較好

6、;乙酰丁香酮的最佳濃度為80μg/ml;24℃下共培養(yǎng)36h-48h時(shí)效率最高;液體共培養(yǎng)技術(shù)簡(jiǎn)便有效。
　　 2、利用PCR技術(shù)成功從轉(zhuǎn)化子中擴(kuò)增出hyg抗性標(biāo)記基因,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子篩選成功。在無(wú)Hyg篩選壓力的連續(xù)5次傳代下,90%的轉(zhuǎn)化子可以穩(wěn)定遺傳。
　　 3、表型觀察的結(jié)果發(fā)現(xiàn),野生型橘青霉與Pci-laeA基因轉(zhuǎn)化株相比其菌絲由淡黃色變成灰白色,孢子和菌絲形態(tài)無(wú)顯著改變。
　　 4、美伐他汀產(chǎn)量檢測(cè)結(jié)果顯