根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、盾葉薯蕷(DioscoreazingiberensisC.H.Wright)，是我國(guó)特有的甾體激素類(lèi)藥源植物，也是世界上薯蕷皂甙元含量最高的資源植物。近些年，由于人類(lèi)的過(guò)度采挖，野生盾葉薯蕷資源瀕臨枯竭，而人工栽培種存在皂甙元含量降低，種質(zhì)退化等問(wèn)題。細(xì)胞和基因工程技術(shù)可望為盾葉薯蕷的品種改良提供一個(gè)新的途徑。本實(shí)驗(yàn)篩選了盾葉薯蕷易組織培養(yǎng)的基因型，并以其三種外植體-幼胚誘導(dǎo)的胚性愈傷，花序愈傷和花序作為轉(zhuǎn)化受體，研究了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的

2、盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化的各種影響因素，獲得了轉(zhuǎn)基因植株，初步建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化體系，為通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)其進(jìn)行品種改良的研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.轉(zhuǎn)化受體的準(zhǔn)備。 (1)基因型篩選。利用盾葉薯蕷四種基因型的幼胚進(jìn)行了愈傷誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：不同基因型的組織培養(yǎng)能力不同，田間編號(hào)為4-73的材料最易進(jìn)行組織培養(yǎng)，幼胚愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)95.3％；其次是4-61，誘導(dǎo)率為91.2％；然后是5-88，誘導(dǎo)

3、率為76.3％；4-72幾乎沒(méi)有誘導(dǎo)出愈傷。選擇最容易組織培養(yǎng)的4-73作為以后研究的材料。 (2)幼胚來(lái)源的愈傷繼代和狀態(tài)改良。4-73的幼胚誘導(dǎo)出來(lái)的初代愈傷，不成顆粒，生長(zhǎng)緩慢，而且水浸狀嚴(yán)重，再生困難，難以直接進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究。通過(guò)調(diào)節(jié)激素種類(lèi)與濃度、基本培養(yǎng)基成分，有機(jī)添加物，改變繼代方式等，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的改良后，產(chǎn)生了白黃色，致密，表面呈顆粒的胚性愈傷。 (3)花序愈傷誘導(dǎo)。取4-73幼嫩的花序，在MS附加0.5m

4、g/L2，4-D，1.0mg/L6-BA或0.2mg/L2，4-D，1.0mg/L6-BA兩種培養(yǎng)基上，均能誘導(dǎo)出高質(zhì)量的愈傷。 2.影響轉(zhuǎn)化的主要因素研究. (1)外植體類(lèi)型對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。利用4-73幼胚來(lái)源的胚性愈傷、花序誘導(dǎo)的愈傷以及花序三種外植體，分別與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，比較GFP的瞬間轉(zhuǎn)化率。幼胚來(lái)源的胚性愈傷轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到49.3％；花序愈傷轉(zhuǎn)化率次之，達(dá)到40.5％；花序的瞬間轉(zhuǎn)化率最低，只有5.5％，不適

5、合直接作為轉(zhuǎn)化的受體。 (2)預(yù)培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。分別用幼胚來(lái)源的胚性愈傷和花序愈傷兩種外植體作為轉(zhuǎn)化受體，比較預(yù)培養(yǎng)與否時(shí)，GFP的瞬間轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明：兩種外植體經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)均比不經(jīng)過(guò)預(yù)培養(yǎng)時(shí)轉(zhuǎn)化率要高，預(yù)培養(yǎng)對(duì)轉(zhuǎn)化有利。 (3)預(yù)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)基成分對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。通過(guò)MS，1/4MS和去掉CaCl2的MS三種基本培養(yǎng)基作為預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)基。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去掉CaCl2的MS最適合用作預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。

6、(4)AS對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。通過(guò)是否添加200μmol/LAS時(shí)的GFP瞬間轉(zhuǎn)化率比較，發(fā)現(xiàn)預(yù)培養(yǎng)和共培養(yǎng)階段，培養(yǎng)基中添加200μmol/LAS有利于提高轉(zhuǎn)化率。 (5)農(nóng)桿菌浸染濃度對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。分別用OD600為0.3，0.5，0.8的農(nóng)桿菌浸染液，感染胚性愈傷后，比較GFP瞬間轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示，盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化的最佳菌液濃度為OD600=0.5。 (6)共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化的影響。用幼胚胚性愈傷作為受體，分別統(tǒng)計(jì)共培養(yǎng)1d、

7、2d、3d、4d后，GFP的瞬間轉(zhuǎn)化率。結(jié)果表明，共培養(yǎng)3d時(shí)瞬間轉(zhuǎn)化率最高。 (7)轉(zhuǎn)化參數(shù)的驗(yàn)證。以幼胚胚性愈傷和花序愈傷為受體，利用含有GUS報(bào)告基因載體的農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)，按照以上得出的轉(zhuǎn)化參素進(jìn)行轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化參數(shù)是否合適。結(jié)果顯示：兩種受體共培養(yǎng)后，經(jīng)過(guò)GUS染液染色過(guò)夜，在大部分外植體上都觀察到藍(lán)斑，從而驗(yàn)證了前面得出的轉(zhuǎn)化參數(shù)是正確的。 3.轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選、擴(kuò)繁和再生，以及轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR的鑒定。

8、 (1)潮霉素篩選濃度的確定。將胚性愈傷轉(zhuǎn)到含有潮霉素9個(gè)濃度梯度的培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)1個(gè)月后，觀察愈傷在各個(gè)濃度上的生長(zhǎng)狀態(tài)，以確定潮霉素的篩選濃度。結(jié)果顯示：在盾葉薯蕷轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，合適的潮霉素篩選濃度為70mg/L。 (2)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選、擴(kuò)繁和再生。共培養(yǎng)后，將各外植體轉(zhuǎn)到響應(yīng)的篩選培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)1-2個(gè)月的篩選，只有幼胚來(lái)源的胚性愈傷作為受體，進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，產(chǎn)生了抗性愈傷，抗性愈傷在不含抗生素的培養(yǎng)基上擴(kuò)繁兩次，在再生培