農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥1號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’是目前黑龍江省高寒地區(qū)唯一可以安全越冬的冬小麥品種，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)小麥進(jìn)行遺傳改良具有重要意義。本研究以冬小麥‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’為試驗(yàn)材料，進(jìn)行成熟胚愈傷組織培養(yǎng)及植株再生的研究，探討了培養(yǎng)基類型、接種方式、添加物組合濃度、2，4-D濃度、6-BA和KT對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、分化及植株再生的影響。初步建立了東農(nóng)冬麥1號(hào)成熟胚愈傷組織培養(yǎng)及植株再生體系。對(duì)成熟胚愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，探討農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中各影響

2、因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響，初步建立了冬小麥‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。研究結(jié)果如下:
　　(1)通過對(duì)冬小麥‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’進(jìn)行成熟胚愈傷組織培養(yǎng)及植株再生試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同接種方式對(duì)成熟胚愈傷組織分化率的影響極顯著，胚切傷略帶胚乳法＞碎胚法＞完整胚法。添加物正交試驗(yàn)獲得最佳激素配比為100 mg·L-1谷氨酰胺+0.1 mg·L-1 NAA+0.3 g·L-1肌醇+1 g·L-1脯氨酸+0.5 mg·L-1 ABA

3、。2，4-D濃度顯著影響成熟胚愈傷組織的分化率和成苗率，隨著2，4-D濃度的升高，誘導(dǎo)率呈先升高后降低的趨勢(shì)，而分化率和成苗率都下降。分化培養(yǎng)基中6-BA對(duì)成苗率影響差異極顯著，在4 mg·L-1時(shí)達(dá)到最大;KT對(duì)愈傷組織的分化要高于6-BA，但對(duì)成苗率的影響明顯低于6-BA。該體系所獲冬小麥愈傷組織的分化率和成苗率分別可達(dá)93.33％和66.64％。初步建立了冬小麥‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’成熟胚組織培養(yǎng)及植株再生體系。
　　(2)菌株類

4、型、共培養(yǎng)方式、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)冬小麥成熟胚愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化效率有很大影響。菌株EHA105的侵染效果比LBA4404更加明顯;共培養(yǎng)時(shí)愈傷組織進(jìn)行干燥處理，其GUS穩(wěn)定表達(dá)率比培養(yǎng)基上共培養(yǎng)高出約2.8倍;隨著預(yù)培養(yǎng)時(shí)間的增加，GUS表達(dá)率上升;隨著菌液濃度和侵染時(shí)間的升高，GUS表達(dá)率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，在OD值為0.8和侵染3h時(shí)達(dá)到最大;隨著共培養(yǎng)時(shí)間的增加，GUS穩(wěn)定表達(dá)率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。通

5、過正交試驗(yàn)獲得最優(yōu)轉(zhuǎn)化方法為預(yù)培養(yǎng)18d的愈傷組織，菌液濃度OD值為0.8，侵染時(shí)間1h，干燥共培養(yǎng)5d，GUS穩(wěn)定表達(dá)率達(dá)到83.33％，初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的東農(nóng)冬麥1號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系。
　　(3)利用建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系，采用攜帶GUS基因和潮霉素抗性篩選標(biāo)記的農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)化‘東農(nóng)冬麥1號(hào)’成熟胚愈傷組織。經(jīng)過抗性篩選，獲得了抗性再生小麥植株，提取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，轉(zhuǎn)化效率為2.86％，為