農(nóng)桿菌介導(dǎo)的指狀青霉轉(zhuǎn)化體系的建立.pdf

1、我國(guó)當(dāng)前作為全世界生產(chǎn)柑橘的第一大國(guó)，在柑橘的采后貯藏、運(yùn)輸過(guò)程中，常發(fā)生各種病原微生物引發(fā)的多種病害，導(dǎo)致柑橘的腐爛，并對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失，其中柑橘綠霉病是最為主要的真菌病害之一。指狀青霉(Penicilliumdigitatum)是柑橘采后主要病害綠霉病的病原菌。其在柑橘采收后從果實(shí)傷口處入侵，并以較快速度侵染果實(shí)，引起柑橘腐爛。
　　為了有效控制該病害，可通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，探明指狀青霉菌的致病機(jī)制，從而更好

2、地防治柑橘綠霉病。本研究探索了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的指狀青霉轉(zhuǎn)化的各項(xiàng)條件，并對(duì)部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了分子分析。結(jié)果如下:
　　初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的指狀青霉轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明:農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系中最適宜指狀青霉?jié)舛葹?×106個(gè)/ml，農(nóng)桿菌濃度為OD600=0.15-0.25，共培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)為48h，進(jìn)行篩選的是40μg/ml的潮霉素B。
　　具體過(guò)程是:將濃度是1×106個(gè)/ml的指狀青霉菌孢子懸浮液，及預(yù)培養(yǎng)過(guò)程中添加了200μmol

3、/l乙酰丁香酮后得到的OD600=0.15-0.25的含質(zhì)粒pTFCM的根癌農(nóng)桿菌AGL-1菌液，等體積混合后在貼有玻璃紙的CO-IM培養(yǎng)基(含200μmol/lAS)上于24℃避光誘導(dǎo)培養(yǎng)48h，將玻璃紙轉(zhuǎn)移至滅菌的培養(yǎng)皿上，在玻璃紙上覆蓋含有40μg/ml潮霉素B和200μg/ml頭孢噻肟鈉的篩選培養(yǎng)基。24℃培養(yǎng)4-5d后，將PDA培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的待定指狀青霉轉(zhuǎn)化子菌落挑至含40μg/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行再次篩選。能生長(zhǎng)

4、者再將其轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基上，傳代5次，一次5天后將其接種于含有40μg/ml潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)4天后，能長(zhǎng)出菌落的即證明獲得的轉(zhuǎn)化子能穩(wěn)定遺傳。
　　對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了分子分析。提取指狀青霉野生菌及其轉(zhuǎn)化子的基因組DNA，用引物hph1和hph2對(duì)6株轉(zhuǎn)化子基因組DNA中的T-DNA插入片段潮霉素B基因hph進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果證明轉(zhuǎn)化子中均含有插入的潮霉素片段。本研究利用Tail-PCR方法初步擴(kuò)增了轉(zhuǎn)化子插入的