水楊酸誘導下人參培養(yǎng)物差異表達基因片段的克隆.pdf

1、本實驗以2年生人參根為外植體，采用MS+2，4-D(4.0mg/L)培養(yǎng)基中誘導形成愈傷組織，在MS+2，4-D(2.0mg/L)+BA(2.0mg/L)+IBA(5.0mg/L)+Vc(30mg/L)的培養(yǎng)基質(zhì)中進行懸浮培養(yǎng)，在細胞懸浮培養(yǎng)物生長的第7d、14d、21d、28d添加10-3mg/L水楊酸，再次證實了在人參細胞的生長對數(shù)期添加水楊酸可提高人參細胞培養(yǎng)物中人參皂苷的含量，與對照相比可提高130％，而在細胞生長的早期添加水楊

2、酸對細胞培養(yǎng)物中的皂苷含量影響不大。同時本實驗觀察得到，水楊酸的添加可以延長人參愈傷組織的培養(yǎng)周期，與未添加水楊酸的人參愈傷組織相比，在愈傷組織培養(yǎng)的第35天，添加水楊酸的人參愈傷組織仍然處于生長旺盛階段，而未添加水楊酸的人參愈傷組織進入衰退期。 本實驗跟蹤了水楊酸添加后過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶三種酶在72小時內(nèi)的變化。結(jié)果表明過氧化物酶的活力在24小時達到最高峰值，其活性可達到對照的1.5倍，隨后活性開始下降，7

3、2小時后與對照基本接近。多酚氧化酶的活力在第18小時達到最大并且其活力在72小時之內(nèi)高于對照。苯丙氨酸解氨酶的活力在24小時后迅速攀升在48小時苯丙氨酸解氨酶的活力達到最大峰值，為對照的1.87倍。這三種酶活性的提高在一定程度上表征了細胞次級代謝的增強，有利于次生代謝產(chǎn)物的合成和積累。 水楊酸作為誘導子，已在多種藥用植物細胞培養(yǎng)中使用，效果顯著。但水楊酸作為誘導子誘導植物次生代謝產(chǎn)物合成的作用機制并不十分清楚。本實驗首次將cDN

4、A-RDA技術(shù)應(yīng)用到藥用植物次生代謝的研究中，優(yōu)化了cDNA-RDA技術(shù)體系。確定了在添加水楊酸后提取總RNA的時間為添加后第24小時，置換合成雙鏈cDNA，合成3對接頭引物，篩選差異片段。經(jīng)差異顯示分析得到一個長為516bp的差異表達片段，通過查詢國際互聯(lián)網(wǎng)與GenBank庫中的核苷酸序列，沒有發(fā)現(xiàn)該基因的同源序列，因此我們認定這是一差異表達的cDNA序列可能來自一條未曾分離的新基因，GenBank中的注冊號為FE900130。其中差