一株抗菌海洋放線菌的分離鑒定及其活性成分的初步研究.pdf

1、本研究以遼寧、山東、浙江、福建、廣西等地采集的海泥樣品中分離、純化獲得的放線菌為供試菌，嗜水氣單胞菌C4eromonas hydrophila，編號ST78-3-3)、腸型點狀產(chǎn)氣單胞菌(Aeromonas punctata f．instestinalis，編號XP91-4-1)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum，編號E-3-11)、殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonida)、哈維弧菌(Vibrioharvey)、

2、大腸桿菌(Eschenchia coli)和金黃葡萄球菌(Staphlococcus aureus)為指示菌，采用瓊脂擴散法和平板孔阱擴散法，篩選出一株具有抗菌譜廣、活性較強的放線菌FA-F-5。通過多相分類法鑒定、水產(chǎn)動物疾病治療試驗、對鯽魚免疫功能的影響試驗、FA-F-5發(fā)酵條件優(yōu)化試驗、抗菌活性物質(zhì)穩(wěn)定性試驗以及對抗菌活性物質(zhì)的初步分離進行了研究，得到如下結(jié)論： 1、FA-F-5的分離鑒定：通過對FA-F-5的16S rD

3、NA序列測定，與GenBank數(shù)據(jù)庫中的16S rDNA序列進行比對，其同弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)的相似率達到98.5％；系統(tǒng)進化樹分析表明二者之間的進化距離相隔較近；結(jié)合放線菌FA-F-5的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化特性，將其確定為弗氏鏈霉菌(Streptomyces fradiae)。 2、FA-F-5發(fā)酵液生物治療試驗：以嗜水氣單胞菌感染健康鯽魚，投喂含有抗菌活性物質(zhì)的藥餌，當飼料中抗菌物質(zhì)

4、用量達到370 μg/kg．d時，鯽魚沒有發(fā)病，解剖內(nèi)臟器官劃平板無嗜水氣單胞菌，證明該活性物質(zhì)在生物體內(nèi)具有較好的抗菌效果；分別以最佳治愈劑量的5倍量和10倍量飼喂鯽魚，其內(nèi)臟和體表未表現(xiàn)任何毒理現(xiàn)象，說明該活性物質(zhì)對鯽魚無急性毒性。 3、FA-F-5發(fā)酵液對鯽魚免疫功能影響試驗： FA-F-5發(fā)酵液經(jīng)濃縮制餌投喂鯽魚，連續(xù)投喂14d，分別于0d,7d,14d檢測鯽魚吞噬細胞殺菌活性和血清凝集抗體效價，以研究該抗菌活性成分對鯽

5、魚免疫功能的影響。結(jié)果表明，試驗組吞噬細胞殺菌活性和血清凝集抗體效價與對照組相比存在顯著性差異(P<0.01)，證明該抗菌活性成分能增強鯽魚的免疫功能。 4、FA-F-5發(fā)酵優(yōu)化試驗：應用正交試驗對海洋放線菌FA-F-5的發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定其最佳培養(yǎng)基配方為：麥芽糖15g/L、黃豆粉25 g/L、CaCO3 1 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO47H2O 0.5 g/L、海鹽10 g/L，最佳發(fā)酵條件為：發(fā)酵培

6、養(yǎng)基初始pH 7、發(fā)酵溫度為25℃、種子液菌齡為48 h、接種量為125mL/L、裝樣量為100 mL/L、發(fā)酵時間為96h。最佳發(fā)酵條件下發(fā)酵液抗菌活性相對于慶大霉素和環(huán)丙沙星的效價分別為為2815IU/mL和61.43 mg/L。 5、FA-F-5抗菌活性成分穩(wěn)定試驗：分別對發(fā)酵液進行不同溫度、pH、光照強度、儲存時間等處理，測定處理前后發(fā)酵液的抗菌活性的變化。試驗結(jié)果證實在處理前后發(fā)酵液中的抗菌活性成分的抑菌圈直徑未發(fā)生變

7、化，說明其具有較強的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，光穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性。 6、抗菌活性物質(zhì)的初步分離純化：FA-F-5發(fā)酵液經(jīng)離心濃縮、732型樹脂吸附、聚酰胺柱層析、醇沉，獲得抗生素粗品。經(jīng)碘化鉍鉀薄層顯色試驗證明該抗生素粗品屬于氨基環(huán)醇類抗生素。 本試驗獲得的具有抗菌活性的放線菌，對于微生物資源的開發(fā)利用具有重要意義。同時對海洋放線菌FA-F-5分類地位、發(fā)酵液生物有效性、發(fā)酵條件優(yōu)化及活性物質(zhì)的初步分離純化進行了初步研究，