海洋放線菌ACMA006抗腫瘤活性成分的分離純化及放線菌素D抗肝癌作用研究.pdf

1、長期以來，惡性腫瘤對人類的健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。藥物治療作為腫瘤治療的主要手段，一直受到人們的重視。微生物是重要的天然產(chǎn)物資源。微生物品種極其多樣，其代謝物的化學(xué)復(fù)雜性和多樣性是研制新藥取之不盡的寶庫。近年來，隨著研究熱點(diǎn)的轉(zhuǎn)移，新藥的研究開發(fā)已突破了陸生資源的束縛，拓展到了生態(tài)和物種更為復(fù)雜多樣的海洋。海洋微生物生存環(huán)境特殊，它們具有一些獨(dú)特的代謝途徑和遺傳背景，可能產(chǎn)生特殊的次生代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類型多樣、活性顯著，是新活性先導(dǎo)化合

2、物的重要來源。近年從海洋來源的微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)新穎的活性物質(zhì)，引起廣泛的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)小組從連云港海域分離所得的96株海洋微生物菌株中篩選出了具有抗腫瘤活性的放線菌ACMA006，并對其進(jìn)行了分類鑒定，確定海洋放線菌ACMA006屬于鏈霉菌屬，是卡伍爾鏈霉菌華盛頓亞種（S．cavourensis subsp．Washingtonensis）的一個新的分離菌株。其發(fā)酵液對多種腫瘤細(xì)胞株都具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；

3、有良好的抗腫瘤活性。本研究以海洋放線菌ACMA006為實(shí)驗(yàn)材料，對其發(fā)酵產(chǎn)物中的抗腫瘤活性成分進(jìn)行分離純化，從中獲得活性單體化合物，并利用核磁共振等波譜分析技術(shù)鑒定其結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，以肝癌HepG2細(xì)胞為受試細(xì)胞株，考察單體化合物體外抗肝癌活性，并進(jìn)一步探討其對肝癌HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制，為活性化合物的臨床提供基礎(chǔ)。 目的： 1、對海洋放線菌ACMA006的發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得抗腫瘤活性成分，并進(jìn)一步鑒定其結(jié)構(gòu)

4、。 2、對分離得到的單體化合物進(jìn)行體外抗肝癌活性研究，并探討其抗肝癌作用機(jī)制，為活性化合物的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)。 方法： 1、建立發(fā)酵提取工藝：海洋放線菌ACMA006經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵后，發(fā)酵液采用溶劑萃取法提取其中的抗腫瘤活性成分，并利用硅膠柱層析、制備薄層及HPLC等方法對萃取物進(jìn)行分離得到單體化合物。 2、利用紅外光譜、質(zhì)譜、核磁共振1H-HMR譜和13C-NMR譜等波譜數(shù)據(jù)對單體化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解

5、析和鑒定。 3、采用MTT法檢測不同濃度的單體化合物作用不同時間后對HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的單體化合物作用不同時間后對HepG2細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡率的影響；并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化。 4、采用Western blot方法檢測單體化合物作用不同時間后，對腫瘤相關(guān)蛋白Survivin及凋亡相關(guān)蛋白酶caspase-3表達(dá)的調(diào)控作用。 結(jié)果： 1、建立發(fā)酵提取工藝，獲

6、得單體化合物。海洋放線菌ACMA006的發(fā)酵液以不同極性的溶劑萃取后，經(jīng)體外細(xì)胞毒活性檢測，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯相的活性和得率較高，因此采用乙酸乙酯作為萃取溶劑，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對乙酸乙酯相進(jìn)行分離和純化。萃取后的粗提物經(jīng)硅膠柱層析、薄層層析和高效液相色譜（HPLC）分離，最終得到化合物A和化合物B。HPLC分析檢測其純度分別為93．1％和94．0％。 2、對分離純化獲得的單體化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析?；衔顱在13C NMR譜中共顯示62個碳信

7、號，其中16個組成actinocin生色團(tuán)，還有23個組成每兩個相同的cyclopentapeptides。根據(jù)1H-HMR譜和13C NMR譜推測該化合物結(jié)構(gòu)分為兩部分：一為肽類結(jié)構(gòu)，另一部分為共軛雙鍵體系，肽類結(jié)構(gòu)可能與共軛雙鍵體系相連。由1H-HMR譜和13C NMR譜可看到該化合物肽類部分的化學(xué)位移有兩組數(shù)據(jù)接近，推測可能為兩個對稱的肽結(jié)構(gòu)，連接在不對稱的基團(tuán)上，化學(xué)位移接近但不完全一致?；衔顱的13C NMR譜信號與文獻(xiàn)報(bào)道

8、的放線菌素D的信號相同，從而確定化合物B即為放線菌素D，其分子式為C62H86N12O16?；衔顰的結(jié)構(gòu)與化合物B相似，可能為放線菌素D的衍生物，具體結(jié)構(gòu)還需進(jìn)一步鑒定。 3、純化獲得的活性成分——放線菌素D對于肝癌細(xì)胞HepG2具有明顯的增殖抑制作用，且呈明顯的時間依賴性及劑量依賴性。流式細(xì)胞儀分析顯示，同一作用時間下，隨著藥物濃度的增加，S期細(xì)胞的比例明顯增多，G1期細(xì)胞的比例明顯下降，呈濃度依賴性。同一作用濃度下，48h

9、組細(xì)胞S期的比例較24h組均有所升高，但僅當(dāng)放線菌素D的作用濃度為50ng/mL時，24h組和48h組之間存在差異，而1ng/mL和10ng/mL濃度下24h組和48h組之間的差異無顯著性。此外，10和50ng/mL的放線菌素D處理HepG2細(xì)胞48小時后，在G0/G1期前出現(xiàn)一個凋亡峰，表明放線菌素D可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而殺死腫瘤細(xì)胞。用50ng/mL的放線菌素D處理后，熒光顯微鏡下可見典型的凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，部分細(xì)胞的核收縮、碎裂

10、，形成凋亡小體：并且，48h組HepG2細(xì)胞凋亡的程度和凋亡細(xì)胞比例較24h組更明顯。 4、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用放線菌素D處理HepG2細(xì)胞24、48、72h后發(fā)現(xiàn)：高濃度（50ng/mL）和低濃度（1μg/mL）的放線菌素D均能下調(diào)Survivin蛋白的表達(dá)水平，且存在一定的時間和劑量依賴性；用同樣濃度的放線菌素D處理后pro-caspase-3蛋白的表達(dá)也均有所下降，隨著放線菌素D作用時間的延長，pro-

11、caspase-3蛋白呈時間依賴性下調(diào)趨勢，且高濃度組對pro-caspase-3蛋白的下調(diào)作用較低濃度組更明顯。說明放線菌素D能通過促進(jìn)pro-caspase-3的裂解，激活caspase-3蛋白的表達(dá)水平來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。上述研究結(jié)果表明，放線菌素D誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞凋亡可能是通過下調(diào)Survivin的表達(dá)，解除原先對caspase-3活性的抑制，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡程序誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。 結(jié)論： 1、從海洋放