布魯氏菌vjbR基因標(biāo)記疫苗株的構(gòu)建、免疫保護(hù)性分析及鑒別診斷研究.pdf

1、布魯氏菌病是一種在世界范圍內(nèi)廣泛流行的人畜共患病，它的流行不僅對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成了嚴(yán)重?fù)p失，而且給人類(lèi)健康帶來(lái)很大威脅。減毒活疫苗是目前預(yù)防布魯氏菌病效果最好的疫苗形式，在國(guó)內(nèi)外有廣泛的使用，然而，由于存在毒力殘存、免疫后無(wú)法鑒別診斷等缺點(diǎn)，其使用受到限制。為了克服現(xiàn)有疫苗的這些缺點(diǎn)，利用敲除抗原基因的方法構(gòu)建標(biāo)記疫苗株，并評(píng)價(jià)標(biāo)記株作為候選減毒活疫苗的可行性，已成為尋找理想減毒活疫苗的一種重要策略。
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)標(biāo)記

2、疫苗株的研究情況，在實(shí)驗(yàn)室前期研究成果的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)16MΔvjbR作為標(biāo)記疫苗株的可行性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。首先采取抗性替換的方法，重新構(gòu)建了vjbR抗性基因替換株，然后對(duì)標(biāo)記菌株的毒力表型進(jìn)行了確認(rèn)，對(duì)其保護(hù)性和保護(hù)機(jī)制進(jìn)行了分析。之后，進(jìn)行了vjbR的體外克隆、表達(dá)，并探討其區(qū)分疫苗免疫與自然感染的能力，建立了鑒別診斷方法。
　　 由于布魯氏菌不含質(zhì)粒，很多外源質(zhì)粒均不能在細(xì)菌中復(fù)制，基于此特點(diǎn)，我們建立了一種快速構(gòu)建布

3、魯氏菌無(wú)痕缺失突變體的方法，并成功構(gòu)建了vjbR的突變株：將vjbR基因兩側(cè)同源臂分別與卡那抗性基因進(jìn)行PCR融合，得到含有兩側(cè)同源臂和抗性基因的突變盒序列，然后利用T載體克隆，將突變盒序列克隆到T載體，將得到的重組載體轉(zhuǎn)入布魯氏菌中，通過(guò)抗性篩選得到vjbR基因被卡那基因替換的缺失標(biāo)記株16MΔvjbR。
　　 用16M△vjbR標(biāo)記株腹腔接種免疫小鼠，在免疫后的2、4、6周分別采集免疫小鼠血清，監(jiān)測(cè)抗體產(chǎn)生，分離小鼠的脾臟，

4、用菌體蛋白刺激，分析免疫后小鼠的細(xì)胞免疫，進(jìn)行免疫保護(hù)性研究。實(shí)驗(yàn)中我們采用了疫苗株Rev.1免疫組做為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水PBS組作為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用缺失標(biāo)記株16M△vjbR免疫的BALB/c小鼠能夠?qū)σ吧闎.melitensis16M產(chǎn)生很好的免疫保護(hù)效果。同時(shí)，突變株誘導(dǎo)了特異性抗體IgG的分泌。其細(xì)胞免疫水平IFN-γ以及IL-10均有分泌。這說(shuō)明缺失標(biāo)記株16MΔvjbR能夠誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，并起到明顯的保護(hù)

5、作用。
　　 缺失標(biāo)記株16MΔvjbR能否作為候選疫苗還與是否有合適的診斷抗原有關(guān)。我們對(duì)布魯氏菌重組蛋白vjbR進(jìn)行了體外表達(dá)，分別用缺失標(biāo)記株16MΔvjbR、野生株B.melitensis16M免疫BALB/c小鼠，用免疫的小鼠血清與純化的蛋白反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)蛋白作為診斷抗原的可能性。通過(guò)Western blot和間接ELISA法對(duì)蛋白的免疫原性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示vjbR能夠作為診斷抗原，可用于區(qū)分疫苗免疫和自然感染。