布魯氏菌減毒活疫苗株adh缺失標記及其鑒別診斷研究.pdf

1、布魯氏病是布魯氏桿菌引起的一種在全世界范圍內廣泛傳播的人畜共患病，嚴重制約著畜牧業(yè)的發(fā)展。在我國把其定為乙類傳染病。根據對宿主的偏好，布魯氏菌分為六個種，分別為馬耳他布魯氏桿菌Br.melitensis、流產布魯氏桿菌Br.abortus、豬布魯氏桿菌Br.suis、綿羊布魯氏桿菌Br.ovis、沙林鼠布魯氏桿菌Br.neotomae和犬布魯氏桿菌Br.canis。目前預防布病最有效的辦法就是接種疫苗，現(xiàn)用的疫苗主要包括減毒活疫苗，滅活

2、疫苗和亞單位疫苗等。由于滅活疫苗接種后不能在動物機體內復制，使用接種量比較大，免疫期較短還要加入適當?shù)淖魟┖蛠唵挝灰呙缟a成本較高等缺點，目前預防布病使用最廣泛的還是減活疫苗。市場上用的減毒活疫苗主要包括A19,S2,M5,104M,Rev.1,RB51等。
　　 雖然減活疫苗對布病的預防控制取得了很好的效果，但同樣存在一些問題，如減活疫苗毒性較強，接種疫苗后的動物患上布病，無法區(qū)別是疫苗感染還是野生株感染。針對上述缺點，本論文

3、將減毒活疫苗的adh基因缺失，使其毒力下降，原核表達adh基因成蛋白，用免疫血清學方法鑒別診斷免疫感染和自然感染，具體試驗如下:
　　 試驗1布魯氏菌減毒活疫苗株adh基因缺失標記
　　 本部分試驗通過基因芯片和蛋白芯片挑選出毒力相關基因adh，adh是表面抗原基因，從我們實驗室中做的蛋白芯片結果來分析，adh蛋白具有診斷抗原性?；赼dh基因的這個特性，選擇布魯氏菌常用的減毒活疫苗株S2，M5，A19以adh基因為靶標

4、基因，運用同源重組的原理，用抗性替代的方法成功構建了缺失adh基因的標記疫苗株。在試驗中，采取了PCR融合的方法，首先擴增adh基因的N，C端同源臂和卡那基因，并將融合在一起構建成突變盒，其中卡那基因在adh基因N，C端同源臂之間;其次將突變盒連接到pMD19-TVector（以下簡稱T載體）構建成突變載體;最后將突變載體電轉到減毒活疫苗株的感受態(tài)細胞中得到減毒活疫苗株adh基因缺失標記株。
　　 試驗2布魯氏菌adh基因缺失標

5、記疫苗株免疫保護性分析
　　 本部分試驗是將上一步得到的布魯氏菌adh基因缺失標記疫苗株做保護力評價分析。首先比較標記疫苗株和原始疫苗株在小鼠脾臟內的生存情況:分別用等量的缺失標記疫苗株和原始疫苗株接種免疫Balb/C小鼠，比較兩者在小鼠脾臟內的生存能力，在免疫后的1周到5周，每周都從免疫小鼠的脾臟分離細菌，系列稀釋后涂板計數(shù)，結果顯示缺失標記疫苗株能在小鼠脾臟內存活，與原始疫苗株相比，分離出來的缺失標記株少，這表明標記疫苗株的

6、毒力有所下降，但仍能在小鼠體內生存;其次比較標記疫苗株和野生疫苗株對小鼠的保護力:分別用等量的標記疫苗株和原始疫苗株免疫Balb/C小鼠，在免疫后5周攻毒同等量的16M，在攻毒后2周，4周，6周分別從攻毒小鼠的脾臟分離細菌，系列稀釋后涂板計數(shù)，結果表示標記疫苗株組比原始疫苗株組分離出來的細菌數(shù)多，但差異不顯著（P＞0.05），可參考在臨床上作為疫苗株使用。
　　 試驗3布魯氏菌adh基因的蛋白表達純化
　　 本部分試驗是

7、通過原核系統(tǒng)將布魯氏菌adh基因表達成蛋白。由于實驗室的前期工作，已經將adh基因載入到了大腸桿菌2566中，所以這部分試驗只需要將adh蛋白誘導表達純化。將構建好的表達載體接到液體培養(yǎng)基LB(LuriabertanimediumLB)中，等其生長到對數(shù)期，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropylβ-D-1-ThiogalactopyranosideIPTG)低溫低轉速誘導蛋白。待誘導完成后，收集并超聲裂解菌體，讓其釋放

8、出蛋白，將菌體蛋白十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodiumdodecylsulfate-PolyacrylamidegelelectrophoresisSDS-PAGE），考馬斯亮藍染色確定目的蛋白成功表達。將收集的菌體蛋白重新SDS-PAGE電泳，根據目的蛋白的道爾頓大小切下對應的條帶，搗碎加入蛋白浸出液，4℃過夜析出蛋白，測濃度并SDS-PAGE驗證。結果表明成功誘導表達純化了adh蛋白，為下步試驗提供了抗原。
　　

9、 試驗4布魯氏菌adh基因缺失標記疫苗株與野生株、原始疫苗株的鑒別診斷
　　 本部分試驗研究主要是通過酶聯(lián)免疫吸附反應(EnzymelinkedimmunosorbentassayELISA)區(qū)分缺失標記株和野生株、原始疫苗株。缺失標記疫苗株缺失adh基因，不能表達adh抗原。用缺失標記株免疫小鼠后，不能使小鼠產生adh抗原的抗體。在本試驗中，用等量的缺失標記株、原始疫苗株和野生毒株免疫小鼠，在免疫后1周，2周，4周分別給免疫小