布魯氏菌S2308Asly缺失株構(gòu)建及其生物學(xué)特征研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種人、畜共患傳染病,該病在世界范圍內(nèi)廣泛流行并嚴(yán)重危害著人、畜健康。
　　體內(nèi)誘導(dǎo)基因與病原菌在宿主體內(nèi)的生存和致病過程相關(guān),開展對體內(nèi)誘導(dǎo)基因在布魯氏菌致病過程中的作用研究,對闡明布魯氏菌病的發(fā)生發(fā)展以及致病機(jī)制具有參考意義。精氨基琥珀酸裂解酶(argininosuccinate lyase,Asly)是由本實(shí)驗(yàn)室篩選和鑒定的布魯氏菌體內(nèi)誘導(dǎo)抗原,為進(jìn)一

2、步探討Asly在布魯氏菌體內(nèi)感染過程中的作用,研究通過制備Asly單克隆抗體、構(gòu)建Asly缺失株,開展對Asly生物學(xué)功能研究,探討Asly在布魯氏菌致病過程中的致病機(jī)制。試驗(yàn)主要包括以下內(nèi)容:
　　先以布魯氏菌S2308的基因組為模板擴(kuò)增Asly基因的全長序列,將其克隆到原核表達(dá)載體pET-28a上,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Asly,轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后,進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE檢測結(jié)果表明,融合蛋白His-Asl

3、y以可溶性方式表達(dá)。大量表達(dá)Asly融合蛋白,并用層析柱純化可溶性的融合蛋白His-Asly。Western blot檢測結(jié)果表明融合蛋白His-Asly有免疫原性。
　　使用純化的His-Asly免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合,用His-Asly蛋白為包被抗原,使用間接ELISA方法對融合細(xì)胞進(jìn)行篩選,最終獲得了一株穩(wěn)定分泌Asly單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,命名為A5F2。BALB/c小鼠腹腔接種雜交瘤細(xì)

4、胞制備單抗腹水,采用間接ELISA方法和WB方法檢測單抗腹水效價(jià),同時(shí)鑒定單抗的特異性和穩(wěn)定性。單抗鑒定結(jié)果表明,A5F2的單抗腹水效價(jià)為5.12×106,WB鑒定結(jié)果表明,該株雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的單抗具有很強(qiáng)的特異性。
　　構(gòu)建自殺質(zhì)粒pUC19-U-C-D,將自殺質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入S2308感受態(tài)細(xì)胞,利用同源重組使氯霉素抗性片段完全取代Asly基因的ORF。PCR篩選、鑒定雙交換的重組陽性菌株。陽性菌株以Asly單抗腹水作為一抗進(jìn)行W

5、B檢測,結(jié)果表明,S2308野毒株的全菌蛋白能被Asly單抗腹水識別,而Asly基因缺失的菌株不能被識別。以上結(jié)果表明成功構(gòu)建了S2308ΔAsly缺失株。
　　用S2308野毒株和構(gòu)建的S2308ΔAsly缺失株感染MΦRAW264.7,提取細(xì)胞RNA并反轉(zhuǎn)錄,以本研究室建立的實(shí)時(shí)熒光定量(real-time)PCR方法檢測和分析S2308野毒株和構(gòu)建的S2308ΔAsly感染RAW264.7后,RAW264.7細(xì)胞的TNF-α

6、、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6及IL-10共6種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平的差異。結(jié)果表明:缺失株侵入至巨噬細(xì)胞后,在0h時(shí),僅IL-4的表達(dá)水平與野毒株侵入后的表達(dá)水平差異顯著;2h和4h時(shí),6種細(xì)胞因子的表達(dá)水平均有顯著的差異;8h時(shí),IL-4、IL-6的表達(dá)水平無差異;36h時(shí),IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的表達(dá)水平無差異。
　　為了解Asly基因的缺失對毒力因子的影響,應(yīng)用本研究建立的方法對per、pmm

7、、sodC、virB4、virB5、virB8、BvrR、BvrS和OMP259種毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析,結(jié)果表明,缺失株中pmm、BvrR、omp25和BvrS四種基因的轉(zhuǎn)錄水平降低,sodC、per、virB4、virB5和virB8的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)。
　　對野生株和缺失株的生長特性、黏附、侵入MΦ的能力及在MΦ的增殖能力進(jìn)行了比較。結(jié)果表明:S2308ΔAsly對MΦ的黏附和侵入能力無明顯變化。胞內(nèi)存活和增殖試驗(yàn)結(jié)果表明,