溶藻弧菌雙組份調(diào)控系統(tǒng)KdpDE減毒活疫苗的構(gòu)建及其交叉免疫保護(hù)性研究.pdf

1、雙組分調(diào)控系統(tǒng)(Two-component Regulatory System)在致病菌的生長(zhǎng)及毒力調(diào)控中起重要作用。本研究克隆了溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）HY9901株組氨酸激酶KdpD和反應(yīng)調(diào)控因子KdpE的全長(zhǎng)基因，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。序列分析結(jié)果顯示，kdpD（GenBank登錄號(hào):KJ544668）全長(zhǎng)1374bp，共編碼457個(gè)氨基酸;kdpE（GenBank登錄號(hào):KJ476728）全長(zhǎng)73

2、2bp，編碼243個(gè)氨基酸。構(gòu)建KdpD和KdpE的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示溶藻弧菌KdpD和KdpE與坎氏弧菌（V.campbellii）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）相應(yīng)蛋白有較近親緣關(guān)系。利用SWISS-MODEL軟件，對(duì)KdpD/KdpE中兩個(gè)相對(duì)保守的功能域HATPase_c和REC進(jìn)行同源建模。
　　本研究采用Overlap PCR和同源重組技術(shù)，結(jié)合正負(fù)向篩選，構(gòu)建三株無(wú)標(biāo)記基因框內(nèi)敲除突變株:△k

3、dpDE、△kdpD和△kdpE，比較突變株和野生株HY9901在生長(zhǎng)速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差異。結(jié)果顯示雙組分調(diào)控系統(tǒng)KdpDE對(duì)溶藻弧菌的生長(zhǎng)曲線和胞外蛋白酶活性的影響不明顯，但是突變株的泳動(dòng)能力和生物被膜形成能力出現(xiàn)下降。斑馬魚致病性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，突變株△kdpDE的毒力下降了78.5倍，突變株△kdpD的毒力下降8.84倍，△kdpE的毒力下降19.6倍，這證實(shí)減毒株構(gòu)建成功。
　　本研究分析了突變株在水體中

4、的存活情況，菌體濃度在106CFU/mL條件下，14d后水體基本檢測(cè)不到突變株;最后考察了其在魚體內(nèi)的存活情況，注射免疫7d后，魚體內(nèi)不能檢測(cè)到該菌，表明該疫苗候選株是比較安全的。
　　以突變株△kdpDE，△kdpD和△kdpE為抗原，分別用注射和浸泡的方式免疫斑馬魚，免疫后第28天用溶藻弧菌和哈維氏弧菌攻毒，評(píng)估該突變株及不同免疫方式對(duì)斑馬魚的保護(hù)效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫后的斑馬魚能夠抵抗溶藻弧菌的感染，其中注射組的免疫保護(hù)率