擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU基因的克隆表達及其免疫保護性研究.pdf

1、擬態(tài)弧菌(Vibrio mimicus)是危害水產(chǎn)動物的重要病原菌之一，不僅可引起魚蟹類嚴重的腹水病，而且還可通過水產(chǎn)動物和水產(chǎn)品感染人類，引起腹瀉和食物中毒。腹水病是我省魚蟹類養(yǎng)殖中常見的疫病之一，控制腹水病的發(fā)生和蔓延已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。細菌外膜蛋白黏附素黏附定植于宿主組織細胞表面是細菌感染的重要初始環(huán)節(jié)，否則細菌就不能在局部定居，繼而產(chǎn)生毒素或侵入深部組織，引起感染發(fā)生。研制以抗黏附作用為主的外膜蛋白疫苗已成為免疫防治

2、細菌感染最有效的措施之一。為此，本課題以擬態(tài)弧菌外膜蛋白OmpU為靶蛋白，在對ompU克隆表達的基礎(chǔ)上研究融合重組蛋白的抗原性和免疫保護性，旨在為研制OmpU基因工程疫苗奠定了基礎(chǔ)。 首先，對擬態(tài)弧菌安徽分離株進行ompU PCR擴增、克隆測序和生物信息學(xué)分析。研究中根據(jù)霍亂弧菌參考株ompU全序列，設(shè)計合成2對分別針對ompU部分序列和全序列的特異性引物，以擬態(tài)弧菌基因組DNA為模板，PCR擴增ompU，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18

3、-T-OmpU，篩選陽性重組克隆進行序列測定和生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示：4株擬態(tài)弧菌安徽分離株均攜帶ompU，ompU片段長為849bp，該基因片段的核苷酸同源性在擬態(tài)弧菌安徽分離株之間以及與霍亂弧菌參考株之間均較高，分別介于94.2％～100％和83.4％～87.6％之間。擬態(tài)弧菌HX4菌株ompU ORF長1 03 8 bp，編碼346個氨基酸，OmpU相對分子量為36.95kDa，其N端前22個氨基酸組成信號肽，N末端氨基酸序列與

4、流感嗜血桿菌HMW黏附素序列具有相似性，在5aa～21aa和201aa～218aa之間有兩個明顯跨膜域，其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和β-折疊為主，間或有β轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲，DNAstar軟件預(yù)測出在OmpU的20aa-34aa、36aa-67aa、73aa-81aa、88aa-112aa、123aa-134aa、143aa-160aa、164aa-174aa、177aa-200aa、217aa-227aa、244aa-259aa、275aa-2

5、88aa、295aa-303aa和314aa-340aa之間存在抗原表位。表明擬態(tài)弧菌OmpU是一種具有較好保守性和抗原性的黏附素孔蛋白。 其次，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-OmpU并進行原核表達。研究中重新設(shè)計l對包含．BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位點的引物，擴增ompU全序列，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-OmpU并轉(zhuǎn)化至Ecoli BL21(DE3)感受態(tài)細胞進行原核表達、產(chǎn)物鑒定和可溶性分析。結(jié)果顯示重組表達質(zhì)粒

6、經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4h后，能在E. coli BL21中表達分子量約為62.9 kDa的融合蛋白GST-OmpU。表明ompU得到了良好的融合表達。 最后，采用免疫印跡和免疫保護性試驗測定融合蛋白GST-OmpU的抗原性和免疫保護性。研究中將純化的Omps、GST-OmpU以及誘導(dǎo)表達菌裂解液經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜進行Western blot檢測。同時以融合蛋白GST-OmpU免疫接種實驗小鼠，四次免疫后進行免

7、疫保護性試驗。結(jié)果顯示GST-OmpU和Omps誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的免疫血清可以相互識別GST-OmpU和Omps，GST-OmpU保留了Omps的某些抗原性，免疫小鼠可部分抵抗50LD<,50>擬態(tài)弧菌的攻擊，免疫保護率為60％。表明OmpU是擬態(tài)弧菌的保護性抗原之一。綜上所述，本研究從分子水平揭示了ompU在擬態(tài)弧菌安徽分離株間以及霍亂弧菌參考株間具有高度同源性，OmpU是一種具有較好抗原性和保守性的黏附素孔蛋白。成功構(gòu)建了pGEX-4T