布魯氏菌保護(hù)性抗原在卡介苗中的表達(dá)研究.pdf

1、布魯氏菌病，簡(jiǎn)稱布病，是由布魯氏菌引起的以流產(chǎn)和發(fā)熱為特征的一種人畜共患傳染病。人感染后常表現(xiàn)為持續(xù)性感染，造成多器官的損害,臨床表現(xiàn)為持續(xù)數(shù)日乃至數(shù)周發(fā)熱（包括低熱），多汗，肌肉和關(guān)節(jié)酸痛，乏力，兼或肝、脾、淋巴結(jié)和睪丸腫大等可疑癥狀及體征。近年來(lái)，疫情出現(xiàn)回升勢(shì)頭?？刂撇剪斒暇〉闹饕侄我琅f是疫苗免疫。目前人常使用的布魯氏菌疫苗是104M。該疫苗對(duì)人的布病預(yù)防起到積極有效作用，但人接種104M后，有較強(qiáng)的副作用，嚴(yán)重影響到布病高危

2、人群對(duì)該疫苗使用的積極性。因此，研制一種副作用小、保護(hù)力強(qiáng)的新型疫苗勢(shì)在必行。
　　本研究以BCG苗為模板擴(kuò)增出Ag85B的DNA片段，并與pBS-T載體連接，連接產(chǎn)物和pMV261用EcoRI/HindⅢ雙酶切，回收產(chǎn)物用T4DNA聚合酶連接得到pMV261-Ag85B載體，同時(shí)以羊種布魯氏菌生物3型05/43株[1]（新疆地區(qū)分離的強(qiáng)毒株）為模板，克隆編碼bp26和omp25的DNA片段，并與pBS-T載體連接得到pBS-T-

3、bp26和pBS-T-omp25，然后分別用EcoRI/HindⅢ、EcoRI/SalⅠ雙酶切pBS-T-bp26、pMV261-Ag85B及pBS-T-omp25、pMV261-Ag85B并回收目的產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA聚合酶連接得到pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25。
　　取重組穿梭質(zhì)粒pMV261-Ag85B-bp26和pMV261-Ag85B-omp25轉(zhuǎn)化到BCG電感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)獲得的重

4、組疫苗株進(jìn)行PCR鑒定；布魯氏菌bp26重組卡介苗陽(yáng)性株（rBCG-bp26和rBCG-omp25）液體培養(yǎng)基中搖菌培養(yǎng)，對(duì)其菌液進(jìn)行westernblot檢測(cè)。用布魯氏菌M5-90疫苗株、rBCG-bp26和rBCG-omp25和BCG疫苗株分別免疫SPF級(jí)BALB/c小鼠，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中CD4+和CD8+T細(xì)胞的含量，純化BP26和OMP25蛋白為抗原，rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠血清為一抗，利用

5、westernblot重組疫苗免疫動(dòng)物的血清學(xué)檢測(cè)，免疫小鼠肝臟和脾臟做組織切片HE染色，觀察組織病理變化。
　　本研究主要獲得如下結(jié)果：
　　1.經(jīng)酶切、PCR和DNA測(cè)序鑒定:表明所克隆的信號(hào)膚Ag85B片段和bp26、omp25片段與文獻(xiàn)報(bào)道一致，pMV261-Ag85B-bp26、pMV261-Ag85B-omp25，的序列正確，連接方向正確，閱讀框與預(yù)期一致。成功獲得重組疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp2

6、5。
　　2.采用電穿孔技術(shù)成功構(gòu)建rBCG-bp26和rBCG-omp25：以重組菌株為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到bp26、omp25的基因片段，westernblot印跡證實(shí)rBCG分泌的蛋白能與布魯氏菌的抗體特異性結(jié)合，證實(shí)rBCG具有免疫原性。
　　3.安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，PBS組、BCG組、rBCG-bp26和rBCG-omp25重組卡介苗組在體征和體重方面無(wú)顯著差異，說(shuō)明rBCG-bp26和rBCG-omp25毒副

7、作用小。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明，BCG疫苗株、重組卡介苗疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫。
　　5.Westernblot分析顯示純化的BP26、OMP25蛋白在與重組疫苗株rBCG-bp26和rBCG-omp25免疫小鼠血清進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)了相應(yīng)的陽(yáng)性條帶，證明重組疫苗株可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抗體。
　　以上結(jié)果表明構(gòu)建的重組疫苗株rBCG-omp25和rBCG-