基于抗原組學技術(shù)篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護性抗原.pdf

1、蛇類在地球上有著廣泛的分布,目前已被發(fā)現(xiàn)的蛇類多達3000多種,其中只有15％的蛇類是具有毒性的,對人類健康造成威脅。毒蛇咬傷主要發(fā)生在熱帶和亞熱帶農(nóng)村地區(qū),特別是低收入國家農(nóng)村地區(qū),因此許多毒蛇咬傷病例未予報告,造成流行病學資料缺失,蛇傷的具體發(fā)病情況難以得到正確統(tǒng)計。據(jù)報道,全球每年大約有2500000蛇咬傷病例發(fā)生,大約有125000人因毒蛇咬傷死亡。在2009年,世界衛(wèi)生組織(WHO)首次承認,蛇咬傷是一個被長期忽視的公眾健康問

2、題。
　　尖吻蝮蛇是我國特有的蛇種,主要分布在中國南方地區(qū),其分泌的毒液中含有多種毒素成分,目前研究較多的毒素成分是金屬蛋白酶(Metalloproteinase)、磷酯酶A2(Phospholipase A2)、絲氨酸蛋白酶(Serine proteases)、C型凝集素(C-type lectin-like protein)。尖吻蝮蛇蛇毒具有很強的血液毒性,中毒后常造成全身系統(tǒng)性的出血,局部組織壞死,給臨床治療帶來困難。

3、>　　噬菌體展示肽庫技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的,用于模擬抗原研究的新技術(shù),這一技術(shù)現(xiàn)已成功的運用于模擬抗原篩選,并能誘導動物產(chǎn)生免疫應答,其基本原理是:在噬菌體表面插入各種組合的氨基酸短肽,通過抗原抗體識別反應,使含有特定蛋白的噬菌體,從肽庫中篩選出來,通過測序獲得特定蛋白的結(jié)構(gòu)和功能信息。現(xiàn)這一技術(shù)在確定抗原表位、篩選小分子模擬肽、疫苗開發(fā)、分子診斷等領(lǐng)域得到了廣泛應用。
　　研究目的:
　　利用尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔,通

4、過實驗純化制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體,并通過動物實驗檢測多克隆抗體的生物活性;在純化尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體的基礎(chǔ)上,利用噬菌體展示肽庫技術(shù),篩選與鑒定尖吻蝮蛇蛇毒保護性抗原,并采用基因工程技術(shù),合成、表達重組抗原肽,對重組抗原肽免疫保護效應進行評估,從而為新型抗蛇毒血清的研究奠定基礎(chǔ)。
　　研究內(nèi)容和方法:
　　第一部分:
　　以尖吻蝮蛇蛇毒免疫新西蘭兔,并利用Econo-Pac Protein A kit及CN

5、Br activated sepharose4B凝膠對兔源性抗蛇毒抗體進行純化,制備特異性尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體,用Western blot和ELISA對抗體進行評價,通過出血抑制實驗及致死性保護實驗評價抗體的生物活性。
　　第二部分:
　　以抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體為靶蛋白,對噬菌體隨機肽庫進行三輪生物淘選,獲得與抗體特異性結(jié)合噬菌體陽性克隆,通過ELISA法和Western blot測定噬菌體單克隆與抗體的結(jié)合力,進一步

6、篩選陽性克隆,對候選陽性克隆進行測序,得到插入短肽氨基酸序列,利用基因工程技術(shù),對篩選獲得的抗原片斷進行串聯(lián)重組表達,獲得重組抗原肽,將重組抗原肽免疫BALB/C小鼠,并通過出血抑制實驗,評估重組抗原肽的免疫保護效果。
　　主要實驗結(jié)果:
　　1)成功地制備了抗尖吻蝮蛇蛇毒多克隆抗體,通過ELISA法檢測,抗蛇毒抗體滴度>1:3200;Western blot分析示:多克隆抗體與蛇毒中大多數(shù)毒素蛋白結(jié)合;體外出血抑制試驗顯示

7、該抗體能有效地抑制尖吻蝮蛇蛇毒所導致的皮內(nèi)出血;在致死性保護實驗中,多克隆抗體對2LD50和4LD50蛇毒分別起到100%和54%的保護作用。
　　2)在本研究中,利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選出5個抗原表位,將該部分抗原進行串聯(lián)重組表達,獲得重組抗原肽,通過 ELISA實驗證明,重組抗原肽能有效的刺激小鼠產(chǎn)生抗體,該抗體能與重組抗原肽結(jié)合,也能被蛇毒抗原識別,與重組抗原肽識別滴度達到1:64000,與蛇毒識別滴度達到1:8000。在