肺癌相關(guān)抗原的篩選及鑒定.pdf

1、腫瘤抗原的尋找一直是腫瘤免疫學(xué)研究中面臨的重要課題。Sahin報(bào)告的SEREX(Serological analysis of recombinant cDNA expression libraries)方法是從體液免疫的角度尋找腫瘤抗原，為尋找腫瘤抗原提供了一種全新的途徑。該方法已經(jīng)用于多種類型的腫瘤抗原的篩選及鑒定，并發(fā)現(xiàn)了一些新的腫瘤相關(guān)抗原，顯示出良好的應(yīng)用前景。 肺癌是全球最普遍的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率均占各種惡

2、性腫瘤之首，從確診到死亡，其五年存活率不到15﹪，如此高的死亡率主要原因是肺癌難以早發(fā)現(xiàn)、早治療，且預(yù)后差。目前肺癌早期診斷的方法有限，因此尋找新的更具優(yōu)勢(shì)的腫瘤相關(guān)抗原用于肺癌的早期診斷是急需研究的課題。 用SEREX法篩選和鑒定肺癌腫瘤相關(guān)抗原的研究在國(guó)內(nèi)外較少。本研究以肺癌患者的血清篩選肺癌組織cDNA表達(dá)文庫，鑒定出肺癌表達(dá)的腫瘤抗原，并對(duì)其中的部分候選抗原做進(jìn)一步的血清IgG抗體檢測(cè)反應(yīng)分析，期望為肺癌的早期診斷和預(yù)后

3、提供新的標(biāo)記物，為肺癌疫苗的研制及免疫效果監(jiān)測(cè)打下基礎(chǔ)，并且為探討肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)理提供依據(jù)。 方法 一、肺癌相關(guān)抗原的異體血清篩選1.將肺癌cDNA表達(dá)文庫鋪板，轉(zhuǎn)膜，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，3﹪脫脂奶粉封閉，同1∶100稀釋的預(yù)吸收血清反應(yīng)后，與1∶5000稀釋的二抗反應(yīng)，在二氨聯(lián)苯胺(DAB)的作用下顯色，抗原抗體復(fù)合物處呈現(xiàn)紫藍(lán)色。重復(fù)鋪板和篩選3次，直到獲得陽性重組噬菌體。

4、 2.挑取陽性噬菌斑，噬菌斑塊于SM緩沖液中4℃保存。陽性克隆經(jīng)過體內(nèi)剪切，成為pBluescript SK-噬菌粒。 3．提取質(zhì)粒，Xho I、EcoR I雙酶切初步鑒定插入片段的大小。 4．質(zhì)粒以T3、T7通用引物測(cè)序，序列結(jié)果用BLAST軟件搜索Genbank，進(jìn)行同源性比對(duì)分析。 二、篩選出的肺癌抗原的初步血清反應(yīng)分析1.將第三輪篩選獲得的陽性重組噬菌體鋪板，轉(zhuǎn)膜，IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，3﹪脫脂

5、奶粉封閉，分剪成大小為1cmx2cm的100份，分別與50例肺癌患者、50例正常人預(yù)吸收血清反應(yīng)后，與1∶5000稀釋的二抗反應(yīng)，在二氨聯(lián)苯胺(DAB)的作用下顯色，抗原抗體復(fù)合物處呈現(xiàn)紫藍(lán)色。 2.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：比較每個(gè)克隆在肺癌病例和正常血清的陽性率，肺癌病例的陽性率高于正常血清的是陽性反應(yīng)克隆。將篩選到的陽性反應(yīng)克隆進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，測(cè)定其靈敏度和特異度。所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件包處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用X<'2>檢驗(yàn)、四格

6、表的確切概率法。 結(jié)果 1.經(jīng)過三輪篩選，從5×10<'5>pfu/ml的文庫篩得70個(gè)陽性克隆，其插入片段大小為300bp～2800bp不等，平均長(zhǎng)度為1.1kb。它們代表63個(gè)不同的基因，包括26個(gè)功能未知的基因，2個(gè)可能的新基因，35個(gè)功能已知的基因。在已知功能的基因中，有1個(gè)基因與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切；34個(gè)基因報(bào)道與細(xì)胞的分化、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等有關(guān)系，與其它腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。 2.在35個(gè)功能已

7、知的基因中選擇5個(gè)肺癌候選抗原基因，用50例肺癌患者和50例正常人血清對(duì)它們介導(dǎo)的IgG免疫反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)、分析，得到3個(gè)陽性反應(yīng)的肺癌相關(guān)抗原克隆。 3.把這3個(gè)陽性反應(yīng)抗原克隆聯(lián)合起來分析，發(fā)現(xiàn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)能夠在保持特異度等基本不變的前提下，明顯提高診斷的靈敏度，具有較大的臨床診斷價(jià)值。結(jié)論本研究鑒定出的肺癌相關(guān)抗原及進(jìn)一步的血清學(xué)分析，有助于進(jìn)一步闡述肺癌的發(fā)生機(jī)制，為肺癌的早期診斷、聯(lián)合檢測(cè)及免疫治療提供候選標(biāo)志物，也為