Fhit相關(guān)基因的篩選及部分基因的鑒定.pdf

1、脆性組氨酸三聯(lián)體(fragile histidine triad，F(xiàn)hit)基因是1996年Ohta等人用外顯子捕獲法克隆并鑒定出來(lái)的第一個(gè)普通型脆性位點(diǎn)基因，該基因橫跨脆性位點(diǎn)FRA3B，定位于染色體3p14.2上。經(jīng)細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤分子生物學(xué)研究，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因、基因敲除等技術(shù)證實(shí)其為一種新的抑癌基因，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在大約70％的人類上皮腫瘤尤其是環(huán)境致癌物誘發(fā)產(chǎn)生的腫瘤中出現(xiàn)Fhit基因缺失、甲基化及Fhit蛋白

2、表達(dá)減少。研究認(rèn)為Fhit通過(guò)Fhit-底物復(fù)合物產(chǎn)生抑癌作用，但Fhit特異的信號(hào)通路及影響腫瘤發(fā)展的作用機(jī)制還不清楚。為了研究Fhit在DNA損傷應(yīng)答中的作用機(jī)制以及Fhit所涉及或參與的信號(hào)通路，我們利用高通量的基因芯片技術(shù)進(jìn)行了電離輻射前后Fhit所影響的基因的篩選及部分基因的鑒定工作。 本實(shí)驗(yàn)首先利用基因芯片技術(shù)將HeLa轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞(HA細(xì)胞)與HeLa轉(zhuǎn)染含野生型Fhit基因載體的細(xì)胞(3-18細(xì)胞)分別進(jìn)行1

3、0Gy電離輻射，并用不輻射的細(xì)胞做對(duì)照，共四組細(xì)胞用Illumina公司的人類全基因組表達(dá)譜芯片Human-6 BeadChip進(jìn)行分析，每個(gè)芯片含有>48，000個(gè)來(lái)自RefSeq的基因信息。對(duì)所得的芯片結(jié)果進(jìn)行了D/C(3-18/HA)、F/E(3-18輻射/HA輻射)、E/C(HA輻射/HA)及F/D(3-18輻射/3-18)差異表達(dá)基因的分析。選擇p值<0.05，通過(guò)比較D/C、F/E、E/C及F/D分別篩選到了648、2820

4、、2816、2825個(gè)差異表達(dá)基因。 然后將篩選到的差異基因，通過(guò)博奧生物公司的網(wǎng)上芯片數(shù)據(jù)分析軟件，在信號(hào)通路和相關(guān)系數(shù)(Pvalue)等方面進(jìn)行了分析，對(duì)沒(méi)有經(jīng)過(guò)電離輻射處理只受Fhit基因影響的一對(duì)細(xì)胞D/C(3-18/HA)的差異表達(dá)基因選擇了CT45-5、IL13RA2、MAGEA1、SPANXB1、MDC1、等上調(diào)基因及SPINK4、SPINK6、IL8等下調(diào)基因進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證；對(duì)經(jīng)電離輻射處理前后Fhit過(guò)表達(dá)

5、的一對(duì)細(xì)胞F/D(3-18輻射/3-18)的差異表達(dá)基因選擇了CDC2、YWHAG、CCNB1、KPNA2等上調(diào)基因進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。 首先是在RNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)RT-PCR的驗(yàn)證，在所選擇的上調(diào)和下調(diào)基因中除了IGFBP3的RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果不符外，其它基因的RT-PCR結(jié)果均與芯片結(jié)果相符。然后在蛋白水平上進(jìn)行了驗(yàn)證，由于篩選到的部分基因沒(méi)有商品化的抗體可買(mǎi)或可購(gòu)買(mǎi)到的抗體效價(jià)不能滿足實(shí)驗(yàn)的要求，所以本研究

6、制備了鼠抗CT45-5、MDC1和SPANXB1的多克隆抗體，用EIJISA和免疫印跡檢測(cè)抗體的滴度及特異性，結(jié)果顯示抗血清效價(jià)可達(dá)到1：12800，且能夠特異識(shí)別原核表達(dá)的CT45-5、MDC1和SPANXB1蛋白。利用制備的多克隆抗體，在蛋白水平上對(duì)CT45-5和MDC1的表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和芯片結(jié)果相符。 本研究通過(guò)基因芯片技術(shù)對(duì)可能受Fhit影響的基因進(jìn)行了篩選，篩選到了大量的基因，為我們進(jìn)一步研究Fhit的作用機(jī)