輻射致癌相關(guān)基因篩選及部分相關(guān)基因作用研究.pdf

1、物理、化學(xué)、生物是環(huán)境致癌的三大因素，而電離輻射是最常見(jiàn)的物理致癌因素之一。隨著核能在國(guó)民經(jīng)濟(jì)和軍事領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，電離輻射對(duì)人類的潛在危害也不斷增加，輻射致癌是最重要的電離輻射遠(yuǎn)后效應(yīng)，對(duì)輻射致癌分子機(jī)理進(jìn)行研究，是腫瘤學(xué)、放射生物學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)與輻射防護(hù)學(xué)探討的重點(diǎn)。輻射的致癌效應(yīng)和其它腫瘤的發(fā)生類似，是個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及到多個(gè)腫瘤相關(guān)基因的改變和功能的異常，諸如p53、p16、AMT、Rb、hRAD50等基因在輻射致癌過(guò)

2、程中都有參與。腫瘤相關(guān)基因編碼的產(chǎn)物(蛋白和酶等)參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳導(dǎo)、損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、增殖分裂、能量代謝調(diào)亡等等一系列機(jī)體的生物學(xué)行為過(guò)程。但是隨著研究的深入，研究者們陷入困惑當(dāng)中：各腫瘤伴發(fā)的相關(guān)基因改變譜隨著種屬、個(gè)體、組織類型以及誘因的不同而存在明顯的不同；在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的各個(gè)時(shí)期基因的改變也不盡相同；在某個(gè)腫瘤的發(fā)生中伴發(fā)的眾多基因的改變中，很難區(qū)別那些基因?qū)δ[瘤的發(fā)生和發(fā)展起重要作用，哪些是腫瘤生成過(guò)程中由于DN

3、A修復(fù)異常及基因組的不穩(wěn)定性引起的繼發(fā)性改變。這些原因使腫瘤發(fā)生機(jī)理的研究變的異常復(fù)雜，有些問(wèn)題急待解決：首先需要研究從正常細(xì)胞受到輻射后到腫瘤的發(fā)生過(guò)程中眾多相關(guān)基因的變化譜；其次是從中挑選出那些在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中扮演了重要角色的基因；此外還需要搞清有哪些新基因在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起了重要作用。因此，高效的篩選出輻射致癌模型中特異性表達(dá)變化的基因并對(duì)其功能進(jìn)行研究就成為研究輻射致癌機(jī)理的非常重要的一環(huán)。 基因芯片技術(shù)是近年來(lái)

4、發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)大規(guī)模篩選腫瘤相關(guān)基因的技術(shù)，具有高效、快速的特點(diǎn)，能在一次實(shí)驗(yàn)中完成成千上萬(wàn)基因的檢測(cè)。自從1996年底stephenfodor博士等人研究的第一塊芯片問(wèn)世以后，芯片技術(shù)發(fā)展迅速，并且很快就廣泛應(yīng)用于腫瘤的研究上?；蛐酒夹g(shù)的局限性在于實(shí)驗(yàn)結(jié)果中存在一定的假陽(yáng)性，另外一個(gè)方面就是特異程度不高。對(duì)于假陽(yáng)性問(wèn)題可以通過(guò)增加實(shí)驗(yàn)重復(fù)次數(shù)，使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)等驗(yàn)證陽(yáng)性結(jié)果來(lái)避免。特異性問(wèn)題主要是與芯片上所點(diǎn)的EST片段

5、選擇有關(guān)系，要解決這個(gè)問(wèn)題一是制備特定的cDNA文庫(kù)自制芯片，而這樣的實(shí)驗(yàn)成本將數(shù)十倍的增加；還有一種辦法是與其它篩選結(jié)果作為相互補(bǔ)充，比如抑制差減雜交(SSH)。SSH也是研究的基因差異表達(dá)的最有效工具之一，其依據(jù)的技術(shù)主要是抑制PCR和差減雜交。該方法得到的cDNA群體不僅富集了差異表達(dá)的基因，而且目的基因間豐度的差異經(jīng)過(guò)均衡化作用已基本消除，特別適用于低豐度克隆的分離。同時(shí)該方法具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。該技術(shù)已經(jīng)成為分子生物

6、學(xué)領(lǐng)域研究?jī)蓚€(gè)細(xì)胞群體間差異表達(dá)基因的有力工具，為研究腫瘤發(fā)生發(fā)展中的基因開(kāi)關(guān)及表達(dá)變化提供了極大的便利，推動(dòng)了細(xì)胞遺傳、生長(zhǎng)、分化及癌變等許多領(lǐng)域的研究。在新基因的全長(zhǎng)mRNA克隆方面，以核酸雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的cDNA文庫(kù)篩選一直被認(rèn)為是一種準(zhǔn)確可靠的方法而廣為應(yīng)用。但這種方法存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力等缺點(diǎn)，尤其是在一些情況下并不能得到其對(duì)應(yīng)的mRNA全長(zhǎng)序列而使其的應(yīng)用受到一定限制。建立在PCR基礎(chǔ)之上的RACE技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上解決了文庫(kù)篩

7、選的這些不足之處，尤其是SMARTRACE技術(shù)的發(fā)明，使一般中小實(shí)驗(yàn)室也可以得到一些新的mRNA序列全長(zhǎng)。 本研究擬綜合利用基因芯片和SSH方法篩選輻射致癌模型中的差異表達(dá)基因，對(duì)得到的部分新的EST片段進(jìn)行全長(zhǎng)mRNA克隆。并從中選取部分基因(已知和功能未知的新基因)研究分析其在輻射致癌過(guò)程中的作用。從而為輻射致癌機(jī)理的進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法： 1.首先以60C0作為輻射源，建立γ射線誘發(fā)的人

8、支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞模型，作為為后續(xù)的研究實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取材。 2.應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)輻射誘導(dǎo)的腫瘤模型進(jìn)行相關(guān)基因篩選：篩選輻射誘導(dǎo)的小鼠胸腺型白血病惡性轉(zhuǎn)化模型的相關(guān)差異表達(dá)基因。并對(duì)部分差異基因的可能作用進(jìn)行分析。 3.使用抑制差減雜交方法對(duì)輻射誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選。對(duì)得到的差異片段進(jìn)行測(cè)序及生物信息學(xué)分析；對(duì)部分篩選出來(lái)的表達(dá)差異基因使用熒光定量PCR方法檢測(cè)并確認(rèn)其變化；將新的EST登錄

9、到GenBank上，并進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析，選出候選的擴(kuò)增全長(zhǎng)序列。 4.從基因芯片篩選的差異表達(dá)基因中選定p16基因，對(duì)γ射線誘發(fā)的小鼠白血病模型中p16蛋白表達(dá)及基因突變進(jìn)行相關(guān)研究。 5.應(yīng)周SMARTRACE技術(shù)克隆新的EST序列T54(GenBankID：EB643248)的mRNA全長(zhǎng)，對(duì)其功能進(jìn)行生物信息學(xué)的初步分析探討。 研究結(jié)果： 1.細(xì)胞輻射誘導(dǎo)的惡性轉(zhuǎn)化模型建立：(1)平板克隆實(shí)

10、驗(yàn)表明在經(jīng)過(guò)22Gy照射培養(yǎng)至35代后，其增殖能力明顯增加；(2)血清抗性實(shí)驗(yàn)提示照射組細(xì)胞在第45代后克隆形成增加；而在照射后50代細(xì)胞軟瓊脂集落的形成能力明顯增加，由對(duì)照的2.86‰增加到13.10‰(P＜0.01)。(3)裸鼠致瘤實(shí)驗(yàn)是證明細(xì)胞惡性的金標(biāo)準(zhǔn)，在種植22Gy50代的8只裸鼠中，經(jīng)過(guò)50天的潛伏期后觀察到一只裸鼠的頸背部形成腫瘤，22Gy60代的8只裸鼠中有4只裸鼠成瘤，由此判斷細(xì)胞發(fā)生明確惡性轉(zhuǎn)化。病理切片及免疫組化

11、證實(shí)為上皮細(xì)胞癌。 2.基因芯片的實(shí)驗(yàn)結(jié)果：腫瘤組與對(duì)照組相比差異在3倍以上的基因共有319條，表達(dá)上升的111條，下降的208條。其中已報(bào)道功能基因?yàn)?47條，另外172條基因?yàn)楣δ芪磮?bào)道的基因片段。 3.成功的利用抑制差減雜交方法建立了惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞模型差異表達(dá)cDNA文庫(kù)：利用通用引物擴(kuò)增后，根據(jù)插入片段長(zhǎng)度不同，從表達(dá)上升和下降的文庫(kù)中各選取40個(gè)有代表性的克隆進(jìn)行測(cè)序。在80個(gè)進(jìn)行測(cè)序的克隆中，得到確定序列的共7

12、3個(gè)。在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)下降的序列41條，Blast比較分析結(jié)果：得到已知序列6條；未知基因的EST序列20條；空載體序列7條；8條為重復(fù)測(cè)定序列。在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中表達(dá)上升的序列32條，Blast分析：已知序列14條；未知基因的EST序列9條；重復(fù)測(cè)定的序列9條。將得到的29個(gè)未知序列登錄到GenBank，序列ID：(EB643220、EB643221、EB643222……EB643248)。對(duì)其中的部分基因改變進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果表

13、明輻射轉(zhuǎn)化組中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表達(dá)量明顯增加(與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)化組中的mRNA分別增加了3.49倍、29.38倍、12.99倍、5.00倍)；而PCBP2、RPL15、TCERG1的表達(dá)量下降(與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)化組中的mRNA分別減少了1.89，48.77，11.95倍)。 4.基因芯片結(jié)果提示p16在輻射誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生中表達(dá)下降，對(duì)p16基因表達(dá)下降的原因進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)白血病模

14、型中p16基因外顯子2有13例發(fā)生缺失，缺失率為33.3％；(2)有9例發(fā)生了外顯子1啟動(dòng)區(qū)域的甲基化，發(fā)生率為23.1％。(3)無(wú)一例發(fā)現(xiàn)堿基突變的發(fā)生。(4)p16蛋白表達(dá)下降比例約為52.4％。 5.克隆了一條新的全長(zhǎng)基因Lcrp369。經(jīng)對(duì)其進(jìn)行初步的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該基因是位于染色體14p22號(hào)臂上的一條功能尚不清楚的基因。其編碼區(qū)域由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成，mRNA全長(zhǎng)1038bp，具有一個(gè)21bp的PolyA

15、“尾巴”，編碼一條長(zhǎng)244個(gè)氨基酸的蛋白，蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)，具有DNA結(jié)合位點(diǎn)及N-糖基化位點(diǎn)、依賴于cAMP/cGMP的蛋白激酶磷酸化作用位點(diǎn)、酪蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)和到N-豆蔻?；稽c(diǎn)。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)推測(cè)為α螺旋蛋白，其分子量為28Kd，等電點(diǎn)為6.19。數(shù)字化組織表達(dá)譜系分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因表達(dá)廣泛，可在多個(gè)組織中表達(dá)及在多種腫瘤中表達(dá)。該基因全長(zhǎng)已經(jīng)登錄到GENBANK上，ID號(hào)DQ525179。 結(jié)論： 1.成功

16、的建立了輻射誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化模型，為輻射致癌發(fā)生的分子機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)取材基礎(chǔ)。 2.基因芯片和抑制差減測(cè)序結(jié)果表明，輻射致癌過(guò)程是個(gè)十分復(fù)雜的多步驟過(guò)程，涉及到眾多基因的參與，其中許多基因?yàn)樾禄?，其功能并不為人所知。表達(dá)顯著改變的已報(bào)道基因(差異在3倍以上)按其功能可分成以下幾類：原癌基因和抑癌基因；與信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)基因；細(xì)胞周期相關(guān)基因；DNA結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄起始因子；細(xì)胞表面抗原和粘附分子基因；代謝相關(guān)的酶和激

17、酶基因；免疫球蛋白基因；DNA合成、修復(fù)和重組蛋白類基因；細(xì)胞骨架蛋白；其它基因。對(duì)這些基因尤其是新基因的研究將有助于對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)和了解。 3.輻射誘發(fā)的腫瘤中p16蛋白含量降低，p16基因表達(dá)下降主要由外顯子2缺失及啟動(dòng)子區(qū)域甲基化引起。p16蛋白表達(dá)下降參與了輻射誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，并可能是輻射誘導(dǎo)致癌的中、晚期事件。 4.生物信息學(xué)的初步分析結(jié)果表明：新基因Lcrp369可在多個(gè)正常組織中及多種腫瘤組織中表達(dá)，其