塵肺病相關(guān)基因篩選研究.pdf

1、塵肺病是目前我國職業(yè)病中發(fā)病率最高、死亡危險性較大、對勞動者危害最嚴重的一類。據(jù)統(tǒng)計目前我國塵肺病例約占職業(yè)病患者總?cè)藬?shù)的近三分之二。塵肺發(fā)病機制十分復(fù)雜，迄今為止尚難以圓滿解釋其發(fā)生過程，對其發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用的分子尚不清楚，也缺乏對其根治或阻止進展的方法。以往研究表明，塵肺病的發(fā)生、發(fā)展是復(fù)雜的多階段過程，其中有眾多細胞和分子的參與及相互作用，因而有可能涉及眾多基因的表達活動。相關(guān)基因在塵肺病發(fā)生、發(fā)展過程中具有不同的作用，但在時間

2、和空間上又可能相互協(xié)調(diào)構(gòu)成一個整體，成為決定塵肺病發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素之一。因此利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段進一步細致觀察塵肺病發(fā)生、發(fā)展的過程，特別是將眾多的塵肺病相關(guān)基因作為一個“基因群”(genecluster)進行研究，篩選出在塵肺病多個環(huán)節(jié)上具有調(diào)控作用的關(guān)鍵基因，揭示塵肺病發(fā)生、發(fā)展在基因水平的本質(zhì)，對于深入研究其分子機制及探索健康監(jiān)護措施、早期診斷方法乃至新的治療手段都具有重要的意義。 此研究以SD大鼠氣管灌注石英粉

3、塵制作矽肺模型，首次采用基因芯片技術(shù)對早期矽肺組織和正常肺組織基因表達譜進行比較研究，首次采用熒光標記mRNA差異顯示技術(shù)對早期矽肺組織中與正常肺組織差異表達的部分基因進行克隆與鑒定，以初步探討矽肺發(fā)病基因水平的分子變化、篩選與矽肺發(fā)生相關(guān)的基因，期望為今后深入研究和闡明塵肺病發(fā)生、發(fā)展過程的分子機制及確認塵肺病的關(guān)鍵性調(diào)控基因提供基礎(chǔ)資料，并為進一步深入研究塵肺病健康監(jiān)護措施、早期診斷方法和新的治療手段提供相關(guān)理論依據(jù)。另外，首次通過

4、對中國河南省漢族煤工塵肺患者和煤塵接觸者的TGF-β1基因-509位點多態(tài)性的檢測，初步探討其在煤工塵肺發(fā)病中的可能作用，期望對于闡明基因多態(tài)性與煤工塵肺等塵肺病的遺傳易感性關(guān)系提供相關(guān)線索和參考依據(jù)。 一、利用基因芯片技術(shù)篩選矽肺相關(guān)基因研究基因芯片是近年來發(fā)展起來的一項新技術(shù)。其原理是將高密度特定的寡核苷酸片段或基因片段陣列作為探針，通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在玻璃片等固相表面上，然后與待測的

5、標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號做出比較和檢測，從而迅速得出相關(guān)的信息?；蛐酒瑸檠芯扛鞣N疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的基因表達譜和關(guān)鍵性基因提供了強有力的工具。 此課題以SD大鼠氣管灌注石英粉塵制作矽肺模型，采用Qiagen公司的共有5705條大鼠基因的基因芯片，首次對早期矽肺組織和正常肺組織基因表達譜進行比較分析研究，篩選出在早期矽肺組織樣品與

6、正常肺組織樣品相比差異表達明顯的基因共323個(包括尚未在GenBank登錄的大鼠全長新基因49個)，其中上調(diào)基因109個、下調(diào)基因214個。提示矽肺發(fā)生可能導(dǎo)致組織細胞功能簡化，且有大量未知基因需要深入研究。這些差異表達的基因涉及參與細胞轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、代謝酶、發(fā)育、細胞構(gòu)建與發(fā)生、細胞運動、分化、細胞周期、細胞粘連、細胞凋亡等重要生命活動的基因及原癌基因。實驗結(jié)果為塵肺病發(fā)生發(fā)展過程中氧化損傷、“鈣超載”損害巨噬

7、細胞、細胞因子作用的存在及免疫反應(yīng)的參與等提供了基因水平的證據(jù)和相關(guān)線索。實驗結(jié)果還提示，原癌基因和抑癌基因在塵肺病發(fā)生過程中的作用及規(guī)律、信號網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)參與調(diào)控塵肺發(fā)生過程中的相關(guān)基因表達規(guī)律、血管內(nèi)皮生長因子及熱休克蛋白等在塵肺中的意義均值得進一步探討。實驗結(jié)果說明，基因芯片技術(shù)在探討塵肺病發(fā)生、發(fā)展的基因水平的分子機制、篩選塵肺病相關(guān)基因及進一步深入研究塵肺病健康監(jiān)護措施、早期診斷方法和新的治療手段等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

8、 二、mRNA差異顯示法篩選矽肺相關(guān)基因研究mRNA差異顯示(mRNADD)技術(shù)可比較不同類型組織(細胞)或相同類型組織(細胞)在不同條件下mRNA水平的差異，是以PCR和聚丙烯酞胺凝膠電泳為基礎(chǔ)的技術(shù)，也是目前常用篩選差異表達基因的方法之一。它利用真核細胞mRNA3’端具有的多聚核昔酸尾Ploy(A)，用錨定引物(T12MN(M=A/C/G，N=A/C/G/T)與mRNA的Ploy(A)尾結(jié)合并錨定緊靠Ploy(A)的兩個堿基，在反轉(zhuǎn)

9、錄酶作用下啟動mRNA群體反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以原3’端錨定引物和5’端的隨機引物所構(gòu)成的引物對對全部cDNA進行PCR擴增。擴增結(jié)果中的每一條帶則代表一種特定mRNA，回收差異條帶、再擴增之后可進行克隆鑒定和比較分析。 此課題以SD大鼠氣管灌注石英粉塵制作矽肺模型，首次采用熒光標記的mRNA差異顯示(FDD)技術(shù)對早期矽肺組織和正常肺組織基因的mRNA差異進行分析，結(jié)果篩選出在早期矽肺組織樣品中表達明顯而在正常肺組織樣品中不

10、表達或表達極少的基因10個。選擇其中的4個進行了克隆、測序并與GenBank進行序列比對，發(fā)現(xiàn)其中一條為編碼載脂蛋白F(ApoF)的基因，另外3條為未知功能的新序列。對ApoF的研究至今仍然很少，其功能尚不清楚，它在矽肺發(fā)病中的作用更是未見報道。因此，尚需進一步研究ApoF與矽肺發(fā)病的關(guān)系，并需運用基因功能分析技術(shù)對另外3條未知功能的新基因進行系統(tǒng)研究。實驗結(jié)果提示，mRNA差異顯示技術(shù)作為快速、有效、經(jīng)濟的篩選新的功能基因的手段，同樣

11、適用于篩選塵肺病相關(guān)基因。 三、轉(zhuǎn)化生長因子β1基因多態(tài)性與煤工塵肺關(guān)系研究目前國內(nèi)外研究者認為多種細胞因子在肺纖維化形成過程中發(fā)揮著重要作用，其中轉(zhuǎn)化生長因子β1的作用尤其受到重視。TGF-β1可能通過上調(diào)膠原和纖維粘連蛋白基因表達促進細胞外基質(zhì)的增多，并可能通過降低蛋白酶分泌和增加蛋白酶抑制劑的分泌抑制基質(zhì)的降解，從而參與肺組織的纖維化過程。研究資料提示TGF-β1基因-509位點存在多態(tài)性，其基因型與TGF-β1蛋白的分泌

12、密切相關(guān)：C/T、T/T基因型可能為高分泌型，C/C基因型則可能為低分泌型。 此課題首次利用PCR-RFLP技術(shù)對中國河南省漢族煤工塵肺患者109例和煤塵接觸者110例的TGF-β1基因-509位點的多態(tài)性進行了檢測，并用TGF-β1ELISA試劑盒檢測了67例塵肺病患者的血清TGF-β1濃度。實驗結(jié)果表明TGF-β1基因-509位點多態(tài)性對中國河南省漢族煤工塵肺發(fā)病的遺傳易感性可能起重要作用，證實TGF-β1基因-509位點C