山羊產(chǎn)羔性能相關(guān)基因的篩選.pdf

1、國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過候選基因法發(fā)現(xiàn)了許多與山羊產(chǎn)羔性能相關(guān)的基因，但都還不能確定這些基因是否是影響山羊多胎性能的主效基因。山羊產(chǎn)羔性能受多個(gè)基因的相互作用，故需對(duì)整個(gè)基因組進(jìn)行研究，系統(tǒng)篩選出與山羊產(chǎn)羔性能相關(guān)的基因、明確各個(gè)候選基因相互作用關(guān)系。
　　本實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)羊只分為三組，A組為經(jīng)產(chǎn)空懷的內(nèi)蒙古絨山羊;B組為經(jīng)產(chǎn)空懷的大足黑山羊;C組為1月齡大足黑山羊，每組各3只，A組和B組年齡相近。羊只屠宰后立即取其卵巢組織，分別取A組、B組、

2、C組卵巢組織，各自提取RNA，構(gòu)建cDNA文庫，然后混合測(cè)序并拼接組裝，進(jìn)行生物信息學(xué)分析。之后，分別對(duì)A、B、C組的cDNA進(jìn)行數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序，比較基因表達(dá)譜差異情況，篩選出與繁殖相關(guān)的差異表達(dá)基因。挑選差異顯著的部分基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，并通過PCR-SSCP分析差異基因在大群體中的多態(tài)性，確定通過表達(dá)譜測(cè)序篩選的差異基因是否是影響山羊產(chǎn)羔數(shù)的主效基因。本實(shí)驗(yàn)共得到如下結(jié)果:
　　1、山羊卵巢組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物

3、信息學(xué)分析
　　測(cè)序共產(chǎn)生了38，771，668條reads，拼接過濾后，得到了64，824條All-Unigenes，其中29，444條Unigene注釋到Gene Ontology數(shù)據(jù)庫、36，910條Unigene注釋到SWISS-Prot數(shù)據(jù)庫、27，766條Unigene注釋到KEGG pathway數(shù)據(jù)庫、11，271條Unigene注釋到COG數(shù)據(jù)庫。GO顯著性功能富集分析發(fā)現(xiàn)有1759條與繁殖相關(guān)的Unigene。

4、
　　2、不同時(shí)期不同繁殖力山羊卵巢組織基因表達(dá)譜分析
　　(1)A組與B組之間有1133條差異表達(dá)基因，其中B組相對(duì)于A組有632條Unigene表達(dá)上調(diào)，501條Unigene表達(dá)下調(diào)。
　　(2)B組與C組之間有709條差異表達(dá)基因，其中B組相對(duì)于C組有349條Unigene表達(dá)上調(diào)，360條Unigene表達(dá)下調(diào)。
　　(3)A組、B組、C組全面比較，發(fā)現(xiàn)三組之間均有差異表達(dá)的Unigene有397條。<

5、br>　　(4)將A、B、C組之間均差異表達(dá)的397條Unigene與轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)的1759條繁殖相關(guān)Unigene比較，發(fā)現(xiàn)這397條Unigene全部都能在1759條Unigene里面找到，說明這397條Unigene即是與繁殖相關(guān)差異表達(dá)基因。
　　3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR
　　比較A、B、C三組的熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及數(shù)字基因表達(dá)譜測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者計(jì)算出的Unigene的基因表達(dá)量變化趨勢(shì)大體相同

6、。說明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確性高。
　　4、PCR-SSCP多態(tài)性分析
　　對(duì)Unigene13218、Unigene7507和Unigene286進(jìn)行PCR-SSCP分析，發(fā)現(xiàn)Unigene13218和Unigene7507的PCR擴(kuò)增片段均沒有多態(tài)性;Unigene286的PCR擴(kuò)增片段有多態(tài)性，但其多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的最小二乘分析差異不顯著(p＞0.05)，說明Unigene286的PCR擴(kuò)增片段中的堿基突變是隨機(jī)性的，Unigen