Tβ4轉(zhuǎn)基因絨山羊中目的基因拷貝數(shù)及表達(dá)量與產(chǎn)絨性能關(guān)系的研究.pdf

1、21世紀(jì)以來，隨著基因工程、顯微注射、體細(xì)胞克隆、胚胎移植等相關(guān)技術(shù)的不斷完善，轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)得到了迅速的發(fā)展。2008年，我國啟動了轉(zhuǎn)基因動物新品種培育的重大專項，轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)與培育取得了顯著性的進展。目前，我國已經(jīng)獲得了多種轉(zhuǎn)基因哺乳動物，本實驗室于2011年也獲得了我國首例胸腺素β4基因轉(zhuǎn)基因克隆絨山羊。研究表明:胸腺素β4的過表達(dá)可以促進毛囊的生長和發(fā)育，而外源基因的拷貝數(shù)和整合位點與外源基因的表達(dá)有著密切的聯(lián)系。因此，本

2、實驗選取產(chǎn)絨性能顯著改善的轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊(NO.91和NO.28)和產(chǎn)絨性能未顯著改善的轉(zhuǎn)Tβ4基因絨山羊(NO.14和NO.94)，分析外源基因的拷貝數(shù)與表達(dá)量之間的關(guān)系;再通過與體細(xì)胞克隆絨山羊(NO.81)的比較，研究Tβ4基因表達(dá)量與產(chǎn)絨量之間的內(nèi)在聯(lián)系，為轉(zhuǎn)基因絨山羊的檢測和轉(zhuǎn)基因新品種的培育提供可靠的技術(shù)方法和理論依據(jù)。
　　1)轉(zhuǎn)基因絨山羊的陽性檢測
　　本實驗首先采用Southern blot和PCR技術(shù)

3、同時篩選轉(zhuǎn)基因陽性絨山羊，然后再利用單一PCR技術(shù)對外源基因的多個位點進行鑒定。結(jié)果表明:四只轉(zhuǎn)基因絨山羊全部為陽性，并且外源基因的多個位點（KAP6.1、Tβ4、CMV啟動子、DsRed和新霉素抗性基因）都整合到轉(zhuǎn)基因絨山羊的基因組中。
　　2)外源基因拷貝數(shù)檢測
　　本實驗以glucagon作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測外源基因的拷貝數(shù)。絕對定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線為: log5N=-0.3794△ Ct+0

4、.8384（R2=0.9969)（△Ct為外源基因Ct與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Ct的差，N代表拷貝數(shù)），計算得到NO.28、NO.91、NO.14和NO.94原代轉(zhuǎn)基因絨山羊中外源基因的拷貝數(shù)分別為2、4、6和1。
　　3) Tβ4基因的相對表達(dá)量
　　選取GAPDH作為內(nèi)參，利用實時定量熒光PCR技術(shù)檢測Tβ4基因mRNA的相對表達(dá)量，結(jié)果表明:內(nèi)源基因GAPDH和目的基因Tβ4標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.999和0.997，擴增效率

5、為0.97和0.96;與體細(xì)胞克隆絨山羊NO.81相比，NO.28、NO.91、NO.14和NO.94的mRNA的相對表達(dá)量分別為2.68、2.46、2.36和2.57倍;選取β-actin作為內(nèi)參，利用western blot技術(shù)檢測Tβ4基因蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量。western blot結(jié)果顯示:與體細(xì)胞克隆絨山羊NO.81相比，NO.28、NO.91、NO.14和NO.94的蛋白質(zhì)相對表達(dá)量分別為1.384、1.380、1.166、

6、0.982倍。
　　4) Tβ4基因在毛囊中的表達(dá)量及絨毛比和產(chǎn)絨量分析
　　采用石蠟切片和免疫組化技術(shù)分析毛囊中Tβ4基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示NO.28、NO.91、NO.14和NO.94的毛囊中蛋白質(zhì)的相對表達(dá)量是分別為體細(xì)胞克隆絨山羊NO.81的1.908、1.442、1.233、1.331倍。應(yīng)用冰凍切片和HE染色來分析轉(zhuǎn)基因絨山羊皮膚中的絨毛比，結(jié)果表明: NO.28、NO.91、NO.14、NO.94和NO.81的