人食管癌轉(zhuǎn)移相關(guān)抗原的篩選及功能的初步分析.pdf

1、研究背景及目的：在全世界范圍內(nèi)食管癌是導(dǎo)致腫瘤死亡的第八大常見(jiàn)腫瘤，而我國(guó)是食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國(guó)家，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第四位，五年生存率低于10﹪。腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，是臨床上絕大多數(shù)腫瘤患者的致死因素。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成及蛋白質(zhì)組學(xué)研究的進(jìn)展，人們逐漸意識(shí)到腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及腫瘤轉(zhuǎn)移性相關(guān)蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。阻止腫瘤表達(dá)的信號(hào)因子及轉(zhuǎn)移相關(guān)因子就有可能防止惡性腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移。尋找腫瘤轉(zhuǎn)

2、移特異性功能性抗原蛋白以及具有重要功能的基因，為阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移提供有價(jià)值的靶點(diǎn)已逐漸成為腫瘤研究的新熱點(diǎn)。本研究是采用中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所抗體工程實(shí)驗(yàn)室首創(chuàng)的“功能性抗體庫(kù)篩選腫瘤相關(guān)功能性基因”的新技術(shù)，重點(diǎn)研究了抗人食管癌細(xì)胞的單抗，并在體外篩選鑒定食管癌轉(zhuǎn)移相關(guān)功能性單抗，初步確定了某些功能性單抗識(shí)別的功能性抗原的分子量，為分離獲得人食管癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的功能性基因奠定了重要的基礎(chǔ)。 方法：本研究根據(jù)對(duì)前期的雜交瘤技術(shù)、經(jīng)酶

3、聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)確定后獲得的485株抗人食管癌組織細(xì)胞的單克隆抗體進(jìn)行了體外功能的檢測(cè)、分析和鑒定。首先采用免疫熒光法檢測(cè)485株單抗對(duì)應(yīng)的抗原表達(dá)譜。然后通過(guò)粘附實(shí)驗(yàn)、遷移實(shí)驗(yàn)從485株單抗中檢測(cè)出明顯抑制人食管癌遷移或粘附的22株單抗，在此基礎(chǔ)上通過(guò)體外侵襲實(shí)驗(yàn)篩選出明顯抑制人食管癌細(xì)胞侵襲的7株單抗。選擇1株抗轉(zhuǎn)移作用較強(qiáng)的單抗3D11，通過(guò)Protein G親和層析柱純化雜交瘤上清，獲得純度大于90﹪的單抗。對(duì)該抗體識(shí)別的抗原蛋白

4、采用細(xì)胞免疫熒光及免疫組化等技術(shù)進(jìn)行了亞細(xì)胞定位及組織表達(dá)特異性的研究。并提取人食管癌細(xì)。胞及食管癌移植瘤的總蛋白，進(jìn)行Dot Blot和Western Blot分析，初步證明了該單抗識(shí)別的功能性蛋白．的分子量。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用means±SD表示，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用方差分析和Student’s t檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)相關(guān)數(shù)據(jù)。結(jié)果： 1．免疫熒光法檢測(cè)485株單抗對(duì)應(yīng)的人食管癌抗原表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)109株識(shí)別的抗原蛋白有表達(dá)，其中1

5、4株單抗對(duì)應(yīng)的抗原表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性(+++)，47株中等強(qiáng)度陽(yáng)性表達(dá)(++)，48株弱陽(yáng)性表達(dá)(+)。 2．粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析了485株單抗對(duì)人食管癌細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附的影響。結(jié)果顯示40株單抗顯著抑制人食管癌細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附。抑制率達(dá)31-76﹪，其中32株單抗與對(duì)照組相比P<0.05，具有顯著性差異。還有8株表現(xiàn)為對(duì)食管癌細(xì)胞與正常血管內(nèi)皮細(xì)胞有促進(jìn)作用。 3．遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)分析了485株單抗對(duì)人食管癌細(xì)胞

6、遷移能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有70株單抗明顯抑制人食管癌細(xì)胞的遷移，49株抑制率可以達(dá)30﹪以上，與對(duì)照組相比其P<0.05，具有顯著的差異。 4．侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了粘附和遷移抑制率較強(qiáng)的22株單抗對(duì)食管癌的侵襲能力的影響。結(jié)果提示7株單抗明顯抑制人食管癌細(xì)胞的侵襲，抑制率達(dá)30﹪以上，與對(duì)照組相比其P<0.05，具有顯著性差異。說(shuō)明這7株單抗可以通過(guò)阻斷轉(zhuǎn)移過(guò)程中的遷移、侵襲等環(huán)節(jié)，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生。 5．成功獲得了

7、1株體外顯著抑制人食管癌細(xì)胞遷移(抑制率為46.53﹪)、侵襲(抑制率為73.0﹪)、粘附(抑制率為13﹪)的功能性單抗3D11。免疫熒光定位在細(xì)胞膜上，免疫組化結(jié)果顯示在腫瘤組織中高表達(dá)，而在正常食管組織中表達(dá)很低。Western Blot實(shí)驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，該抗體識(shí)別的抗原蛋白的分子量為100kDa或300kDa為分離該功能性抗原/基因奠定了重要基礎(chǔ)。 結(jié)論： 1．從485株抗人食管癌細(xì)胞的單抗雜交瘤株中，經(jīng)體外免疫熒光方

8、法篩選獲得了109株表達(dá)相應(yīng)抗原蛋白的功能性單抗。 2．采用體外粘附實(shí)驗(yàn)篩選成功地獲得了40株明顯抑制人食管癌細(xì)胞與正常食管內(nèi)皮細(xì)胞粘附的功能性單抗。 3．通過(guò)體外遷移實(shí)驗(yàn)篩選出49株能顯著抑制人食管癌細(xì)胞遷移的功能性單抗4．在通過(guò)體外粘附實(shí)驗(yàn)和遷移實(shí)驗(yàn)篩選的功能性單抗中選擇22株單抗進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示有7株單抗明顯抑制人食管癌細(xì)胞侵襲，抑制率為32～80﹪，與對(duì)照組相比具有顯著性差異(p<0.05)。