宮頸癌輻射抵抗相關(guān)miRNAs的篩選及初步功能研究.pdf

1、背景和研究目的：
　　宮頸癌(cervical carcinoma,CC)是發(fā)展中國家女性第一高發(fā)惡性腫瘤,放射治療是宮頸癌治療的重要手段之一。然而,接受根治性放療的局部晚期宮頸癌患者仍然有30％左右出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,導(dǎo)致治療失敗。其腫瘤細(xì)胞或腫瘤輻射抵抗特性可能是放療后復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的主要原因。研究表明引起腫瘤的輻射抵抗機(jī)制十分復(fù)雜,目前認(rèn)為可能包括腫瘤細(xì)胞DNA損傷與修復(fù)異常、低氧環(huán)境和低氧誘導(dǎo)因子形成、腫瘤干細(xì)胞的存在、以及相

2、關(guān)的microRNAs產(chǎn)生等多種因素。深入研究腫瘤輻射抵抗的形成機(jī)制或分子網(wǎng)絡(luò),對于有效改善腫瘤輻射治療質(zhì)量具有重要意義。
　　microRNAs(miRNAs)是近年來研究的熱點(diǎn),是真核生物體內(nèi)一種內(nèi)源性的非編碼小RNA,在體內(nèi)主要發(fā)揮基因沉默作用。大量研究顯示,miRNA和多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有報道顯示異常表達(dá)的miRNA與白血病、肺腺癌、乳腺癌、胰腺癌等疾病的化療抵抗、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。但是,miRNA異

3、常表達(dá)與宮頸癌輻射敏感型或輻射抵抗的關(guān)系,尚有待研究闡明。本研究首先通過具有輻射敏感性差別的宮頸癌組織,篩選宮頸癌輻射抗性相關(guān)miRNAs,然后通過宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染等技術(shù),進(jìn)行miRNA的功能驗證和效應(yīng)機(jī)制探討,為臨床預(yù)測宮頸癌放療預(yù)后、逆轉(zhuǎn)宮頸癌輻射抵抗、提高腫瘤治愈率提供新的思路和依據(jù)。
　　材料和方法：
　　1.選擇我科八例宮頸癌患者組織標(biāo)本,三例放療后三年內(nèi)無復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者為對照組(輻射敏感組),三例局部復(fù)發(fā)、

4、兩例轉(zhuǎn)移患者為實驗組(輻射抵抗組)。采用美國 Affymetrix公司 microRNA芯片進(jìn)行基因表達(dá)譜的差異性篩選,數(shù)據(jù)庫版本和圖像分析軟件分別為miRBase Release20和GenePix pro V6.0。
　　2.采用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)對基因芯片結(jié)果進(jìn)行驗證,并在宮頸癌輻射敏感及宮頸癌輻射抵抗的組織標(biāo)本中,對所選差異表達(dá)miRNA表達(dá)水平進(jìn)行驗證。
　　3.采用基因轉(zhuǎn)染方法,經(jīng)特異miRNA前體和抑

5、制物上調(diào)或下調(diào)HeLa及SiHa宮頸癌細(xì)胞miRNA表達(dá)水平,CCK-8、克隆形成、劃痕實驗、Transwell侵襲實驗、流式細(xì)胞術(shù)等觀察輻射后細(xì)胞增殖、侵襲能力、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期變化。
　　4.采用多個生物信息網(wǎng)站對 miR-4778-3p可能調(diào)控的下游靶基因進(jìn)行初步預(yù)測,查閱相關(guān)文獻(xiàn),對miR-4778-3p調(diào)控輻射抵抗的可能機(jī)制進(jìn)行初步探索。
　　5.研究結(jié)果采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,采用獨(dú)立樣本的t檢

6、驗,P<0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　主要結(jié)果：
　　1.通過miRNA芯片篩選,共獲得32個與宮頸癌輻射抵抗相關(guān)的差異表達(dá)miRNA分子,差異性表達(dá)均在2倍以上(p<0.05);與輻射敏感組織相比,在復(fù)發(fā)患者中發(fā)生表達(dá)上調(diào)miRNA分子共10個,表達(dá)下調(diào)9個。在遠(yuǎn)轉(zhuǎn)患者中表達(dá)上調(diào)9個,表達(dá)下調(diào)4個。其中,miR-4778-3p在復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移患者中的表達(dá)水平均明顯下調(diào)。RT-PCR結(jié)果與芯片結(jié)果具有良好一致性,結(jié)果表明miR

7、-4778-3p在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中表達(dá)降低(p<0.01)。
　　2.使用特異性miR-4778-3p前體或抑制物轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞系HeLa及SiHa使其表達(dá)水平升高或降低后發(fā)現(xiàn),與對照細(xì)胞相比,上調(diào) miR-4778-3p的表達(dá)顯著抑制細(xì)胞輻射后的增殖活力、克隆形成和侵襲能力,而下調(diào)miR-4778-3p的表達(dá)水平后,宮頸癌細(xì)胞系的細(xì)胞活力顯著增加。然而,與對照組相比,改變 miR-4778-3p的表達(dá)水平,對輻照誘導(dǎo)的細(xì)胞

8、凋亡和細(xì)胞周期無影響。
　　3.通過生物學(xué)靶基因預(yù)測分析,初步結(jié)果顯示XRCC2、IRS2、IGF2BP2、CDH2、MEMO1、MYH7、ASH1及Slit1等靶基因可能受到miR-4778-3p的下游調(diào)控。但對于其確切調(diào)節(jié)作用和機(jī)制,需要進(jìn)一步的實驗驗證。
　　初步結(jié)論：
　　1.本研究發(fā)現(xiàn)miR-4778-3p宮頸癌輻射敏感及輻射抵抗組織中表達(dá)水平有顯著差異,細(xì)胞實驗上調(diào)或下調(diào) miR-4778-3p能夠降低或升