人食管癌Eca-109細(xì)胞膜腫瘤抗原篩選的研究.pdf

1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文人食管癌Eca109細(xì)胞膜腫瘤抗原篩選的研究姓名：李付廣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：病理學(xué)和病理生理學(xué)指導(dǎo)教師：董子明20040515鄭州大學(xué)2004年博上學(xué)位論文人食瞥癌Eca109細(xì)胞膜腫瘤抗原篩選的研究細(xì)胞集落刺激因子(grantdocytemacrophagecolonystimulatingfactorGM—CSF)、白細(xì)胞介素4(imerleukin一4，IL一4)及該志愿者血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)

2、胞密度后，加入24孔板中培養(yǎng)。于培養(yǎng)的第4天，根據(jù)一定比例加入膜蛋白，第6天加入LPS促進(jìn)DC成熟，于第7天收獲成熟的懸浮DC。冷凍保存抗原負(fù)載的成熟DC：含有10％DMSO和5％葡萄糖的純自身血清作為凍存液，可以將密度為10106／ml抗原負(fù)載的成熟DC，以每分鐘降溫1℃，放置于液氮的氣相中保存。6人外周血T細(xì)胞的培養(yǎng)：在IL一2維持下，流式細(xì)胞儀檢測(cè)此志愿者PBMC的分化情況。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，再收獲PBMC，經(jīng)過(guò)換培養(yǎng)瓶及PHA刺激，

3、以含ML，2的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)PBMC4周，收集純化的T細(xì)胞。7MTT法測(cè)定致敏T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性：以純化的T細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，加入抗原負(fù)載的成熟DC，以8：1、16：1、32：1的效靶比分別加入Eca109細(xì)胞(其為靶細(xì)胞)；同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組及效應(yīng)對(duì)照組，各組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用MTT法在96孔板中測(cè)定CTL的細(xì)胞毒活性。8弱酸洗脫法：?jiǎn)螌由L(zhǎng)的Eca一109細(xì)胞每天按如下方法處理：去掉培養(yǎng)液，PBS洗三次，每瓶加5

4、ml枸櫞酸磷酸鹽緩沖液(pH33)室溫作用lmin，使MHC分子變性，釋放MHC分子結(jié)合的肽入上清液。腫瘤細(xì)胞經(jīng)PBS洗3次，用培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。每瓶細(xì)胞最多酸洗3次棄去。含有肽的酸洗液經(jīng)過(guò)SepPakC18柱脫鹽、真空濃縮和MicroconYM一3(Millipore)超過(guò)濾，20℃凍存。9反相高效液相(RPHPLC)分析：Eca109細(xì)胞細(xì)胞膜酸洗肽用HPLC分離，流速1ml／min，用O％一70％梯度(v／v)0085％TFA的乙腈

5、溶液(B液)洗脫，水相為含0085％TFA的水溶液。手動(dòng)收集各峰，脫鹽、濃縮和干燥，20℃凍存。lO月中瘤特異性細(xì)胞毒性(CTL)T淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo)：取該志愿者負(fù)載不同組分抗原肽的DC作為刺激細(xì)胞，在刺激細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入自身外周血淋巴細(xì)胞，于24ti后，再加入等體積的含20U／mlrhIL2繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液1次。每7天應(yīng)用刺激細(xì)胞重復(fù)刺激淋巴細(xì)胞1次，共培養(yǎng)21天。11”cr釋放試驗(yàn)檢測(cè)CTL殺傷活性：Eca109細(xì)胞為靶細(xì)胞，在