抑癌基因肺癌腫瘤抑制物1(TSLC1)對人食管癌Eca-109細胞株生長和凋亡的影響.pdf

1、[目的]
　　 構建新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因肺癌腫瘤抑制物1(TSLC1)真核表達載體及探討重組載體對人食管癌Eca-109細胞株生長和凋亡的影響,為進一步明確抑癌基因TSLC1對食管癌可能的作用機制奠定理論基礎。
　　 [方法]
　　 1.TSLC1基因真核表達載體的構建
　　 1.1根據(jù)GenBank提供的TSLC1基因的cDNA序列,設計特異性引物,用RT-PCR擴增TSLC1的ORF,克隆至pMD19-

2、T simple載體中,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliJM109中,雙酶切鑒定篩選陽性克隆,進行序列測定。再將其回收后連接入真核表達載體pIRES2-EGFP表達載體中,轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli JM109中篩選。
　　 1.2取陽性重組真核表達載體擴增抽取質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定后,陽性重組載體命名為pIRES2-EGFP-TSLC1,并雙酶切鑒定分析證實。
　　 2.TSLC1基因?qū)θ耸彻馨〦ca-109細胞株生長和凋亡的影響<

3、br>　　 2.1瞬時轉(zhuǎn)染食管癌細胞并鑒定TSLC1基因表達
　　 采用陽性脂質(zhì)體Lipofectamine2,000瞬時轉(zhuǎn)染pIRES2-EGFP-TSLC1載體和空白pIRES2-EGFP載體至食管癌Eca-109細胞中,命名轉(zhuǎn)染有pIRES2-EGFP-TSLC1的食管癌Eca-109細胞為實驗組,轉(zhuǎn)染有pIRES2-EGFP的食管癌Eca-109細胞為陽性對照組,野生型食管癌Eca-109細胞為空白對照組。轉(zhuǎn)染48小時

4、后抽取實驗組細胞總RNA,通過RT-PCR檢測TSLC1的mRNA表達情況。
　　 2.2指標檢測
　　 2.2.1觀察轉(zhuǎn)染后48小時三組細胞形態(tài)學改變
　　 2.2.2 MTT法測定轉(zhuǎn)染后12～72小時三組細胞增殖與抑制
　　 2.2.3流式細胞儀測定轉(zhuǎn)染后48小時三組細胞的細胞周期
　　 2.2.4采用Annexin-V/PI雙染法測定轉(zhuǎn)染后48小時三組細胞的凋亡
　　 [結果]

5、>　　 1.pIRES2-EGFP-TSLC1的構建和鑒定
　　 RT-PCR擴增獲得約1400bp的TSLC1基因ORF,經(jīng)限制性酶切鑒定證實后成功插入pIRES2-EGFP-TSLC1真核表達載體中。重組體pIRES2-EGFP-TSLC1經(jīng)測序及Bg1Ⅱ/EcoRⅠ雙酶切鑒定后得到與GenBank提供的TSLC1基因的cDNA序列(AY358334)高度同源。
　　 2.pIRES2-EGFP-TSLC1轉(zhuǎn)染后的

6、鑒定
　　 瞬時轉(zhuǎn)染后24、48和72小時,通過熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,結果顯示實驗組和對照組細胞帶有綠色熒光;轉(zhuǎn)染48小時后通過RT-PCR測定實驗細胞中TSLC1基因的表達,結果顯示實驗組存在TSLC1基因表達。
　　 3.細胞形態(tài)變化
　　 實驗組細胞呈圓形或橢圓形,聚集成團,細胞團之間疏散,細胞狀態(tài)較差;對照組和空白組細胞呈多邊形或梭形,細胞之間交織緊密,細胞生長旺盛。
　　 4.MTT檢測結果<

7、br>　　 MTT結果顯示:與對照組和空白組比較,實驗組細胞生長速度減慢,增殖受到明顯抑制。
　　 5.細胞周期檢測結果
　　 結果顯示:實驗組G0/G1期細胞比例(74.47％±1.89%)明顯高于對照組(64.33±2.87,P＜0.01)和空白組(63.77±3.06,P＜0.01),而S期細胞比例(8.23%±4.24%,P＜0.05)降低,表明實驗組細胞周期發(fā)生了G0/G1期阻滯。
　　 6.細胞凋亡