熊果酸體內外抗人食管癌Eca-109細胞的作用與機制.pdf

1、目的：熊果酸（Ursolic acid，UA）是從天然藥用植物中提取的五環(huán)三萜類化合物，近年來研究表明其具有顯著的抗腫瘤活性，但具體機制仍不明確；有關于UA抗人食管的報道較少。本實驗擬研究UA對體外培養(yǎng)的人食管癌細胞Eca-109的誘導凋亡、抑制增殖作用及其可能的機制，并建立人食管癌裸鼠移植瘤動物模型，進一步探討UA在體內對Eca-109細胞的生長抑制作用與機制。 方法：1.UA體外作用于Eca-109細胞的實驗研究：①MTT法

2、檢測不同濃度UA（0、10、20、30、40、50μmol/L）作用于Eca-109細胞24、48、72h后的增殖抑制作用，并分別計算IC50。②透射電鏡觀察經(jīng)0、18.32（1/2 IC50）、36.65μmol/L（IC50）UA作用48h后細胞超微結構的改變。③Hoechst33258熒光染色觀察不同濃度UA（0～50μmol/L）作用48h后Eca-109細胞的凋亡形態(tài)變化。④流式細胞術分析經(jīng)0～50μmol/L UA處理48h

3、后細胞周期分布與凋亡率。⑤Western blot分析不同濃度UA（0～50μmol/L）作用48h后對Eca-109細胞P27kip1、Bax、Bcl-2等蛋白表達的影響。 2.UA作用于人食管癌裸鼠移植瘤的實驗研究：①建立12只人食管癌Eca-109細胞裸鼠移植瘤動物模型，成瘤后隨機分為四組，每組三只。分別給予0.2ml生理鹽水、25、50、100mg/Kg/d UA腹腔隔天注射治療，治療14天后處死裸鼠，稱瘤重、計算抑瘤率

4、。②HE染色觀察各組腫瘤組織與裸鼠重要器官（肝、腎、心、肺、脾等。）組織形態(tài)學變化。③透射電鏡觀察各組腫瘤組織超微結構的改變。④TUNEL法檢測各濃度UA對腫瘤組織凋亡指數(shù)的影響。⑤免疫組化染色分析各組腫瘤組織COX-2、Bax、Bcl-2等蛋白表達的變化。 結果：1.體外實驗研究結果：①20～50μmol/L UA對Eca-109細胞具有顯著的增殖抑制作用（P<0.01），并具明顯的量效、時效依賴性，作用24、48、72h后的

5、IC50分別為41.57，36.65，32.81μmol/L。②18.32～36.65μmol/L UA處理48h后的Eca-109細胞在電鏡下見典型的凋亡小體形成。③UA作用后Hoechst33258染色見Eca-109細胞核固縮變小、熒光亮度增強。④流式細胞分析結果顯示UA將Eca-109細胞阻滯在G0/G1期，增殖指數(shù)隨著UA上升而下降，而凋亡率隨之增加。⑤Western blot結果提示UA下調Eca-109細胞Bcl-2表達，

6、上調Bax、P27kip1表達。 2.體內實驗研究結果：①UA能抑制移植瘤生長，經(jīng)25、50、100mg/Kg/d UA作用后的抑瘤率分別為19.85％、49.60％、71.16％。②HE染色結果提示UA處理后的腫瘤組織細胞間質增多，細胞密度下降，核分裂相減少，部份細胞出現(xiàn)核固縮、碎裂等凋亡形態(tài)改變，裸鼠重要器官未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。③電鏡下觀察到實驗組腫瘤組織凋亡形態(tài)學改變。④TUNEL法檢測各組凋亡指數(shù)分別為1.70％±1.0

7、5，3.53％±0.60，13.47％±1.07，29.60％±2.89。⑤免疫組化染色提示UA上調腫瘤組織Bax表達，下調COX-2、Bcl-2表達。 結論：UA能誘導體外培養(yǎng)的Eca-109細胞凋亡、抑制細胞增殖，其作用與下調Bcl-2、上調Bax的表達，提高P27kip1表達將細胞阻滯在G0/G1期有關；同時UA能抑制人食管癌裸鼠移植瘤生長，下調Bcl-2、上調Bax的表達誘導腫瘤細胞凋亡、抑制COX-2表達可能是其作用機