抑制S100A7基因?qū)κ彻馨┘毎鸈ca-109侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響_3371.pdf

1、背景與目的:食管鱗狀細胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）在中國每年新診斷病例約有25萬而且世界上食管癌病死率最高的國家也為中國。我國食管癌總發(fā)病率為22.14/100,000，死亡率為16.77/100,000，位居癌癥死因第四位,尤其是中晚期患者行手術(shù)治療后總的5年生存率不足10％，但TNM分期較早的患者及時行外科手術(shù)根治性切除后，其5年生存率能夠達到90%以上。因此，提高生存率的關(guān)

2、鍵就在于早期診斷及治療，而尋找鑒定食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)控因子及其作用的分子機制，對于其早期診斷及靶向治療均具有重要而深遠的意義。目前研究證實包括食管鱗癌在內(nèi)的多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）具有密切聯(lián)系，EMT的發(fā)生發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵步驟為轉(zhuǎn)錄因子snail通過與E-cadheirn啟動子區(qū)的E盒結(jié)合下調(diào)E-cadheirn的表達。
　　目前大量的

3、研究資料表明，鈣調(diào)節(jié)蛋白S100A7在多種惡性腫瘤組織中存在高表達（如頭頸部鱗癌、食管癌、胃癌、宮頸癌等），可能參與了腫瘤細胞的增殖分化、發(fā)生發(fā)展，然而在食管鱗癌的研究中對其機體的分子機制及各影響因子之間的相互作用卻缺少深入細致的研究。本項研究中，采用實時熒光定量PCR(Real Time-PCR)及免疫組織化學技術(shù)(immunohistochemistry)驗證S100A7 mRNA和其相應(yīng)功能蛋白在食管鱗癌組織、癌旁組織和正常食管組

4、織中的表達水平，然后依據(jù)S100A7 mRNA及其蛋白的具體表達水平進一步分析臨床病理參數(shù)與二者表達量之間的相互關(guān)系及其臨床意義；然后運用RNAi技術(shù)敲減S100A7在食管鱗癌細胞系Eca-109中的表達，研究其表達量下調(diào)后對食管癌細胞體外增殖和侵襲能力的影響；進一步研究S100A7表達下調(diào)對E-cadheirn, vimentin和snail表達的影響，探討其與食管鱗狀細胞癌發(fā)病機制之間的相互關(guān)系；最終建立裸鼠移植瘤模型，并觀察S10

5、0A7 si-RNA注射對荷瘤模型的影響。
　　總之本研究以S100A7作為研究的分子靶點，利用Real Time-PCR、免疫組化及小分子RNA干擾等技術(shù)對S100A7在食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及其可能機制進行初步研究和探討，共分為3個部分。
　　第一部分、S100A7在食管鱗癌組織中的表達研究
　　方法:
　　1.采用Real Time-PCR及免疫組化技術(shù)驗證S100A7 mRNA及其相應(yīng)的功能蛋白在食管鱗

6、癌組織、癌旁組織及正常食管組織的表達情況，并進一步探究臨床病理參數(shù)與二者表達水平之間的關(guān)系及其臨床意義。
　　2.采用Kaplan-Meier生存曲線進一步分析食管鱗癌患者生存預后與S100A7 mRNA及其蛋白表達情況的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.采用Real Time-PCR和免疫組織化學方法檢測食管鱗癌組織、癌旁組織及正常食管組織中均有S100A7 mRNA和蛋白的表達且表達水平呈依次下降趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(

7、P＜0.05)。
　　2.S100A7 mRNA及其蛋白的表達與性別、腫瘤分化程度的高低及腫瘤體積的大小之間不存在相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；但與患者年齡、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移及TNM分期水平的高低相關(guān)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析后發(fā)現(xiàn)食管鱗癌患者生存預后與S100A7 mRNA及其蛋白的表達水平呈負相關(guān)。
　　第二部分、S100A7對食管鱗癌侵襲轉(zhuǎn)移能力

8、的影響及其作用的分子機制
　　方法:
　　1.采用 RNAi技術(shù)使得食管鱗癌細胞系Eca-109中 S100A7表達下調(diào)，并利用Real Time-PCR及Western-blot檢測敲減后S100A7 mRNA及蛋白的表達量，利用CCK-8法及Boyden小室檢測S100A7表達水平下調(diào)對于食管鱗癌細胞株Eca-109增殖及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　2.采用RNAi技術(shù)使S100A7表達下調(diào)，觀察S100A7表達下調(diào)

9、對食管鱗癌細胞株Eca-109表達E-cadheirn, vimentin和snail的影響。
　　結(jié)果:
　　1.S100A7 si-RNA能成功下調(diào)食管癌細胞Eca-109中S100A7 mRNA及蛋白的表達水平(P＜0.05)。
　　2.食管鱗癌細胞株Eca-109的增殖活性及其侵襲遷移能力在S100A7表達水平下調(diào)后受到明顯抑制且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3.S100A7表達水平下調(diào)導致食

10、管鱗癌細胞株Eca-109的E-cadheirn表達量明顯上升，而vimentin和snail表達量顯著下降且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　第三部分、S100A7 si-RNA對裸鼠體內(nèi)食管癌移植瘤的抑制作用
　　方法:
　　1.采用食管鱗癌細胞株 Eca-109進行裸鼠移植瘤模型構(gòu)建，隨機分為3組并瘤旁注射等量的S100A7 si-RNA、對照si-RNA及PBS觀察對移植瘤生長的影響；
　　2.采

11、用Real time-PCR及免疫組化檢測瘤旁注射S100A7 si-RNA對移植瘤組織中S100A7、E-cadheirn、vimentin及snail表達水平的影響；
　　結(jié)果:
　　1.采用瘤旁注射S100A7 si-RNA能夠有效抑制移植瘤的生長(P＜0.05)；
　　2.瘤旁注射S100A7 si-RNA能夠明顯抑制移植瘤組織中S100A7、vimentin及snail的表達水平，但能提高E-cadheirn

12、的表達水平，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.S100A7 mRNA及其蛋白在食管鱗癌組織、癌旁組織及正常食管組織表達量呈現(xiàn)逐級遞減的趨勢，且在食管鱗癌細胞株Eca-109中也有表達，表明S100A7與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為食管鱗癌轉(zhuǎn)移及預后的分子標志。
　　2.通過RNAi技術(shù)可抑制食管鱗癌細胞株Eca-109中S100A7表達水平，進而抑制食管鱗癌細胞株Eca-109增殖活性