華蟾素對食管癌細(xì)胞系Eca109體外增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　通過觀察華蟾素(Cinobufacini)對人食管癌細(xì)胞Eca109體外增殖及bcl-2、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases DNMT)、P16mRAN表達(dá)的影響，探討華蟾素對人食管癌細(xì)胞Eca109的抑制作用及可能的作用機制。
　　方法:
　　1.分別用濃度為0、0.2、1、5、10、20、50mg/ml華蟾素作用人食管癌Eca109細(xì)胞48h，用MTT比色法檢測華蟾素作用后對

2、Eca109細(xì)胞體外增殖的影響。
　　2.用Hoechest33258染色法激光共聚焦顯微鏡觀察不同濃度華蟾素對Eca109細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響。
　　3.Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同濃度華蟾素對Eca109細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.PI染色流式細(xì)胞技術(shù)檢測不同濃度華蟾素對Eca109細(xì)胞周期的影響。
　　5.采用熒光定量RT-PCR檢測不同濃度華蟾素對Eca109細(xì)胞bcl-2、DNMT1、D

3、NMT3A、 DNMT3B、 P16 mRAN表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果:
　　1.MTT法檢測不同濃度華蟾素對Eca109細(xì)胞增殖抑制作用，結(jié)果顯示華蟾素能抑制Eca109細(xì)胞增殖，不同濃度華蟾素（0.2、1、5、10、20、50mg/ml）的抑制率分別為(15.26％、27.42％、44.09％、55.60％、67.03％、67.03％)，采用OD值作為統(tǒng)計數(shù)據(jù)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=266.17，P＜0.05)。

4、>　　2.Hochest33258熒光染色激光共聚焦顯微鏡下觀察華蟾素處理過的Eca109細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示:細(xì)胞核呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染及細(xì)胞凋亡小體等細(xì)胞凋亡形態(tài)。
　　3.流式細(xì)胞儀檢測顯示華蟾素可以促進Eca109細(xì)胞凋亡且隨藥物濃度增加凋亡率增加。不同濃度華蟾素（0、1、5、10 mg/ml）致Eca109細(xì)胞凋亡率分別為(1.33％、14.90％、23.43％、31.26％; F=87.06, P＜0.05)。

5、
　　4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期顯示華蟾素可以將Eca109細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的S期和G2/M期。不同濃度（0、1、5、10 mg/ml）S期比例分別為(20.75％、23.42％、28.44％、33.60％; F=35.70，P＜0.05); G2/M期比例分別為(16.47％、26.65％、42.56％、51.42％; F=97.43, P＜0.05)。
　　5.qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，華蟾素能下調(diào)Eca109細(xì)胞b

6、cl-2 mRNA的表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=536.51，P＜0.05)。
　　6.qRT-PCR檢測結(jié)果顯示華蟾素對Eca109細(xì)胞p16 mRNA表達(dá)無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.671，P＞0.05)。
　　7.qRT-PCR檢測結(jié)果顯示華蟾素對Eca109細(xì)胞DNMT1 mRNA的表達(dá)無明顯影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.807，P＞0.05)，但華蟾素可下調(diào)DNMT3A、DNMT3B mRNA的表達(dá)，差

7、異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=115.08，P＜0.05; F=143.20，P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.華蟾素對人食管癌細(xì)胞具有增殖抑制作用，其抑制作用在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴性。
　　2.Hoechest33258染色顯示華蟾素能誘導(dǎo)Eca109細(xì)胞凋亡。
　　3.流式細(xì)胞周期結(jié)果表明華蟾素可將Eca109細(xì)胞阻滯在S期及G2/M期。
　　4.RT-PCR結(jié)果顯示華蟾素能下調(diào)bcl-2 mRNA的表達(dá)，這