丁酸鈉誘導Eca-109細胞凋亡的研究.pdf

1、組蛋白(Hi．one)是將。DNA組裝和包裹形成核小體的小分子堿性蛋白。核組蛋白的乙?；饔煤腿ヒ阴；饔门c基因的轉(zhuǎn)錄有關，且在調(diào)節(jié)基因表達和染色質(zhì)凝集方面具有重要作用，因此，提出一種可通過抑制去乙酰化酶的作用進而治療人類腫瘤的新的治療方式。近些年，大量研究資料顯示，去乙酰化酶抑制劑通過調(diào)節(jié)大多數(shù)基因表達發(fā)揮其不同的抗癌作用，并且目前已被應用于多種臨床試驗研究中檢測它的效用。丁酸鈉(sodium butyrate,SB)是膳食纖維在腸道

2、中酵解后產(chǎn)生的一種無毒的短鏈脂肪酸，是人體最基本的生理性去乙?；敢种埔蜃?，對預防結(jié)直腸癌的發(fā)生有重要的保護作用。早期研究證實丁酸鈉具有抑制細胞增殖和誘導細胞分化以及促進體外多種腫瘤細胞凋亡的作用。然而，丁酸鈉誘導細胞凋亡以及下游受體參與凋亡發(fā)生的機制目前還不清楚。 大量研究表明細胞接受凋亡信號刺激后，至少經(jīng)過兩條特征性的凋亡途徑即Caspase(Cysteinyl aspartate-specific proteinases)

3、依賴和非依賴途徑。其中一種是凋亡發(fā)生的主要途徑，即通過結(jié)合Fas受體由此激活Caspase-8啟動凋亡的Caspase依賴途徑。有活性的Caspase-8同時也激活Bcl-2家族的促凋亡因子，如Bax能觸發(fā)一系列的凋亡事件發(fā)生，導致線粒體膜的通透性增加、線粒體腫脹、線粒體內(nèi)膜的跨膜電位(△ψm)下降，以致線粒體中細胞色素C和Smac/Diablo釋放入胞漿，細胞色素C與Apaf-1結(jié)合Caspase-9形成凋亡體(apoptosome)

4、，并在dATP輔助下，激活Caspase-9。Caspase-9再酶解Caspase-3前體，釋放出C末端小肽片段，從而活化Caspase-3，并參與到級聯(lián)反應中，裂解個別的酶作用底物如PARP，引起線粒體DNA斷裂和形態(tài)學改變等細胞凋亡特征。與此同時，Smac/Diablo結(jié)合上Caspase-3抑制物，增加Caspase-3活性。CaspaLse不是唯一引起細胞凋亡的影響因子，一些其他的線粒體前凋亡蛋白如AIF是以Caspase非依

5、賴方式調(diào)節(jié)細胞凋亡同時從線粒體內(nèi)膜間隙被釋放出來。AIF以caspaSe非依賴的方式位移到細胞核并參與染色質(zhì)初期的凝集和大多數(shù)DNA斷裂。近年來，丁酸鈉誘導細胞凋亡中與Caspase所起的相關作用報道很多，例如，丁酸鈉通過改變蛋白活性加強肝癌細胞對Fas信號途徑Caspase的敏感性；丁酸鈉誘導的肺癌，前列腺癌和宮頸癌細胞凋亡需要激活的Caspase-3的參與；丁酸鈉治療白血病和成神經(jīng)管細胞瘤與凋亡中的Caspase-8有關：在結(jié)直腸腫

6、瘤細胞中丁酸鈉誘導細胞發(fā)生凋亡關鍵是有細胞色素C釋放及Casper9的參與等。到目前為止，AIF等細胞凋亡誘導因子在凋亡過程中所起的作用，特別是在丁酸鈉誘導的食管癌細胞株Eca-109細胞凋亡是否有AIF參與還沒有相關報道。 本試驗利用MTT比色法和DNA瓊脂糖電泳檢測Eca-109細胞凋亡的發(fā)生；利用Western blotting技術，通過研究細胞色素C從線粒體轉(zhuǎn)移到胞漿，AIF從線粒體內(nèi)膜的釋放等凋亡發(fā)生事件以及與Casp

7、ase的關系，來進一步闡明丁酸鈉誘導食管癌細胞株Eca-109細胞凋亡發(fā)生的機制。 方法 1.MTT法測定丁酸鈉對Eca-109細胞的生長抑制率。試驗分三組：①試驗組：分別加入lmmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L三種不同濃度的丁酸鈉；②陰性對照組：不加藥物；③空白對照組：加入等體積的生理鹽水。每個濃度設四個平行孔，分別作用Eca-109細胞24h、48h、72h后測定細胞在570nm波長吸光度值，計算細胞生

8、長抑制率，以上試驗重復3次，求平均值。 2.用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細胞凋亡；用western blotting技術檢測2.5mmoFL，丁酸鈉處理Eca-109細胞后，Caspase-8的活性在不同作用時間的表達情況以及檢測在丁酸鈉處理前后線粒體和胞漿中細胞色素C及凋亡相關蛋白AIF蛋白表達的變化，并用圖文分析系統(tǒng)進行分析。 結(jié)果 1-丁酸鈉對Eca-109細胞的增殖抑制作用丁酸鈉對Eca-109細胞生長有明

9、顯的的抑制作用。丁酸鈉濃度為1mmol/L、2.5mmol/L、5 mmol/L處理Eca-109細胞，分別測定各濃度組在24h、48h、72h后細胞生長抑制率。處理24h后各濃度組細胞生長抑制率分別為13．38﹪、33．40﹪、39．04﹪：處理48h后各濃度組細胞生長抑制率分別為14．06﹪、34．25﹪、46．50﹪；處理72h后各濃度組細胞生長抑制率分別為32．10﹪、40．65﹪、48．23﹪。細胞生長抑制率隨藥物濃度增加、作

10、用時間延長而升高，具有明顯的時間—劑量依賴性。與1mmol/L組比較：2．5 mmol/L和5 mmol/L濃度組在24h、48h、72h的各個時間段比較均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；與2．5mmol/L組比較：5 mmol/L濃度組在24h、72h時間段有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，5 mmol/L濃度組在48h有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與24h比較：在48h時5 mmol/L濃度組有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，72h時各濃度組

11、均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與48h比較：2．5 mmol/L濃度組在72h有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，1mmol/L濃度組在72h有統(tǒng)計學顯著性差異(P<0.01)。 2．丁酸鈉誘導Eca-109細胞凋亡的作用2．1丁酸鈉2．5mmol/L作用于Eca-109細胞48h、72h后，DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，加藥組有明顯的DNA梯形凋亡條帶，未加藥組無明顯的DNA梯形凋亡條帶出現(xiàn)。 2．2 Western blotti

12、ng技術檢測2．5mmol/L丁酸鈉處理Eca-109細胞在Oh、12h、24h、48h、72h后的Caspase-8的活性，發(fā)現(xiàn)從12h開始出現(xiàn)caspases-8的活性單位，到48h達到高峰，72h與48h的caspases-8活性單位沒有明顯差別。結(jié)果顯示caspases-8活性單位隨著丁酸鈉處理時間延長表達增強，具有一定時間依賴性。結(jié)果表明丁酸鈉誘導Eca-109細胞凋亡可能依賴caspases凋亡途徑進行。 2．3 W

13、estern blotting技術檢測Eca-109細胞中有細胞色素C及AIF蛋白分布。2．5mmol/L丁酸鈉細胞處理48h后二者在線粒體中表達明顯降低，而在胞漿中表達增強。 結(jié)論 1．丁酸鈉對Eca-109細胞有顯著的抗增殖作用，其抗增殖作用呈明顯的劑量—時間依賴關系。 2．丁酸鈉抗Eca-109細胞增殖是通過誘導細胞凋亡而進行，可能是以Caspase依賴及非依賴兩種方式進行。 3．丁酸鈉誘導Eca-