非小細胞肺癌吉非替尼耐藥相關miRNA的篩選與鑒定.pdf

1、研究背景：
　　microRNA(miRNA)是一類長度約22核苷酸的非編碼單鏈RNA，在轉錄后水平調節(jié)基因的表達。研究表明，miRNA的異常表達與多種癌癥相關，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，并且與腫瘤細胞的耐藥性密切相關。吉非替尼是一種表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI），廣泛應用于非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的臨床治療并取得了良好的療效，但頻繁出現的耐

2、藥現象限制了其進一步的發(fā)展。本研究通過miRNA芯片技術，檢測吉非替尼耐藥的NSCLC細胞株與敏感株中miRNA表達的差異，篩選出與NSCLC耐藥相關的miRNAs，初步探討miRNA與NSCLC吉非替尼耐藥的關系。
　　研究方法:
　　1．細胞培養(yǎng)
　　用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為保持PC9/GR的耐藥性，該

3、細胞需培養(yǎng)在含吉非替尼的2μmol/L的上述培養(yǎng)液中，于實驗的前3d更換為無吉非替尼的上述培養(yǎng)液。細胞呈貼壁生長，3至5d傳代1次，選擇對數生長期的細胞實驗。
　　2．CCK8法測定PC9/GR對PC9的耐藥倍數
　　取對數生長期細胞消化，制備成單細胞懸液，PC9/GR以濃度2.5×104mL-1、PC9以2×104mL-1，接種于96孔板中（100μL/孔）。實驗分為PC9/GR組和PC9組，每組分實驗組和對照組。培養(yǎng)24

4、h，分別加入終濃度為0.222、0.667、2、6、18、54μmol/L及0.0056、0.0167、0.05、0.15、0.45、1.35μmol/L的吉非替尼，終體積為200μL，每組濃度4個復孔。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，棄去舊液，每孔CCK8與培養(yǎng)液以1:10比例加入，繼續(xù)培養(yǎng)40min，用酶標儀測定各孔OD450值。采用CompuSyn軟件計算吉非替尼的IC50值（半數抑制濃度），實驗重復3次。
　　3．

5、總RNA的提取及質量檢測
　　Norgen Biotek試劑盒Total RNA Purification Kit提取總RNA。獲得RNA樣品用微量紫外分光光度計測定RNA在230、260和280nm波長的吸收值，得出RNA濃度并通過 A260/A280及 A260/A230的吸收比值判斷 RNA純度。采用Agilent2100分析儀檢測RNA完整性。
　　4．miRNA芯片檢測及數據分析
　　芯片由美國LC Scie

6、nces公司制作，含有最新版本探針序列（Sanger miRBase Ver.16.0），包括人類已經確定的1212個miRNA探針，每個探針重復3次。采用激光掃描儀采集雜交圖象、Array-Pro軟件對雜交圖像進行數字化轉換。數據處理和分析首先是扣除背景，計算重復點平均值和標準偏差，然后通過 LOWESS過濾進行標準化。本實驗為雙色標記實驗，計算兩種檢測信號的比值(log2)和t檢驗的p值，以P＜0.01定義顯著差異性表達。
　

7、　5．熒光定量PCR檢測miRNA表達
　　將miRNA芯片分析結果中差異表達較顯著且信號值較高的9個miRNAs進一步行熒光定量PCR分析。分別取2種細胞總RNA進行逆轉錄，以U6作為內參照。PCR反應程序：預變性95℃20s，1cycle；變性95℃10s,退火60℃20s,延伸70℃5s,40 cycle。反應體系：SYBR Green Mix（包括Taq酶、dNTP mix、PCR Buffer、SYBR Green I）

8、9μL，逆轉錄產物2μL、Forward Primer2μL、Reverse Primer2μL、加水至總體積為20μL。ABI7500 Real-time PCR儀進行檢測，數據采用2－ΔΔCt法進行分析。
　　6．miRNA mimics/inhibitor轉染效率的檢測
　　將miRNA mimics（模擬物）及mimics NC（對照）以50nmol/L濃度轉染至PC9/GR中，miRNA inhibitor（抑制劑

9、）及inhibitor NC（對照）100nmol/L轉染至PC9/GR中，24h之后提取其總RNA，熒光定量PCR檢測實驗組與對照組相比的miRNA表達量。
　　7．CCK8法檢測吉非替尼的敏感性
　　取對數生長期PC9/GR細胞以濃度2.5×104mL-1接種于96孔板中，在各實驗組中轉染miRNA mimcs/inhibitor，對照組中轉染mimcs/inhibitor NC，24h后加入4μmol/L、8μmol/

10、L吉非替尼，作用72h后CCK8法（步驟同上）檢測細胞存活，計算抑制率。
　　8．統(tǒng)計學方法
　　IC50值采用CompuSyn軟件計算;各組間比較采用SPSS13.0進行單因素方差分析或t檢驗;檢驗水準α=0.01。
　　研究結果：
　　1．PC9及PC9/GR對吉非替尼的IC50值及耐藥倍數
　　CCK8結果顯示，吉非替尼對PC9和PC9/GR細胞的增殖均有抑制作用。吉非替尼對PC9和PC9/GR細胞的

11、IC50值分別為42.89nmol/L和3.87μmol/L，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），耐藥倍數為90.23倍。
　　2．miRNA芯片樣品總RNA的質量鑒定結果
　　從PC9和PC9/GR中提取總RNA，用微量紫外分光光度計測量吸光值，結果顯示A260/280分別為1.96和1.92，A260/230分別為2.22和2.31，表明所提取的總RNA純度較高。Agilent2100分析儀檢測結果顯示28S和18S核

12、糖體RNA亮而濃，28S/18S值PC9為2.0、PC9/GR為1.4，表明總RNA完整性好。質量檢測結果表明，總RNA樣品質量符合芯片要求。
　　3．PC9和PC9/GR中miRNA表達譜差異
　　通過對PC9和PC9/GR中miRNA表達譜數據進行分析，P＜0.01的miRNAs有55條，其中在耐藥株PC9/GR中上調的有21條，包括miR-1246、miR-125b等；下調的有34條，包括miR-224、miR-125

13、a-5p等。表達差異2倍以上的25條。
　　4．熒光定量PCR驗證芯片結果
　　將 miRNA芯片結果中差異表達較顯著且信號值較高的9條 miRNAs（miR-224、miR-125a-5p、let-7e、miR-99b、miR-762、miR-200b、miR-1246、miR-125b、miR-15a）進一步采用熒光定量PCR檢測，其中8個miRNA芯片結果相符，僅miR-15a與芯片結果相反，提示miRNA芯片結果基本

14、能正確反映PC9和PC9/GR細胞株中miRNA的表達差異。
　　5．轉染效率
　　將50nmol/L miR-224 mimics及其NC對照轉染至PC9/GR中，mimics組中miR-224的表達量相對與NC對照組提高了約1502倍；將100nmol/L miR-1246 inhibitor及其NC對照轉染至PC9/GR中，inhibitor組中miR-1246的表達量相對與NC對照組減少了約68%。
　　6．C

15、CK8法檢測吉非替尼的敏感性
　　進一步將miR-224、miR-125a-5p、let-7e、miR-99b、miR-762、miR-200b、NC mimics及miR-1246、miR-125b、NC inhibitor轉染至PC9/GR中，予4μmol/L、8μmol/L吉非替尼作用，72h后 CCK法檢測細胞存活，觀察 miRNA對吉非替尼敏感性的影響。
　　在4μmol/L吉非替尼中，miR-125a-5p mi

16、mics組的抑制率相對于對照組降低30.55%，P＜0.01；在8μmol/L吉非替尼中，miR-125a-5p mimics組的抑制率相對于對照組降低33.03%，P＜0.01。
　　結論：
　　1．非小細胞肺癌吉非替尼耐藥細胞株和敏感細胞株miRNA表達差異顯著。
　　2． miRNA芯片是篩選差異表達miRNA的有效工具。
　　3．轉染miRNA mimics/inhibitor可以調控細胞中目的miRNA