非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼治療反應(yīng)的影響因素及聯(lián)合應(yīng)用CIK細(xì)胞的臨床意義.pdf

1、研究背景與目的：以吉非替尼為代表的表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）酪氨酸激酶抑制劑在改善晚期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）療效與生活質(zhì)量中的作用已經(jīng)得到國際多中心臨床研究的充分肯定。研究證實(shí)：吉非替尼對具有EGFR激酶區(qū)域特征性突變的NSCLC（外顯子19缺失及外顯子21 L858R突變）患者療效顯著。但這些患者隨著治療時(shí)間的

2、延長，最終均不可避免地產(chǎn)生耐藥而導(dǎo)致疾病進(jìn)展。此外，并非所有負(fù)載上述活性突變的NSCLC者均享有同等療效，部分病人即使初始有效卻極易發(fā)生耐藥。因此，闡明制約吉非替尼發(fā)揮藥效和產(chǎn)生耐藥的影響因素及其機(jī)制，探討與之協(xié)同的調(diào)節(jié)治療方法，創(chuàng)立新的聯(lián)合治療模式，對于更好發(fā)揮吉非替尼的藥效潛力，進(jìn)一步提高肺癌的臨床治療水平，具有重要的意義與價(jià)值。本研究旨在解析NSCLC對吉非替尼耐藥的相關(guān)因素及可能的機(jī)制，研究細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（cytokine

3、 induced killer cells，CIK細(xì)胞）過繼輸注與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用的意義，探討其作為一種新的臨床治療模式在克服耐藥、改善療效中的可能作用與地位。
　　 研究內(nèi)容與方法：
　　 第一部分 吉非替尼對NSCLC的療效及其影響因素
　　 收集廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤血液中心接受吉非替尼250mg/天治療的33例NSCLC患者的外周血標(biāo)本，及50例手術(shù)后復(fù)發(fā)的NSCLC患者的腫瘤組織標(biāo)本（6例接受吉非替

4、尼治療的患者同時(shí)收集了外周血和腫瘤組織標(biāo)本）。酶切富集PCR法分析EGFR基因外顯子19、21突變，比較性別、吸煙史對EGFR基因突變檢出及吉非替尼治療反應(yīng)的影響；免疫組化檢測NSCLC患者組織標(biāo)本中EGFR、p-Erk、p-Akt、p-Stat3和p53的表達(dá)，探討吸煙影響NSCLC患者吉非替尼治療反應(yīng)的可能機(jī)制。
　　 第二部分 吉非替尼耐藥人肺腺癌PC-9細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性
　　 選擇吉非替尼敏感的人肺腺癌

5、PC-9細(xì)胞株（EGFR基因外顯子19 E746-A750缺失，p53突變），采納大劑量吉非替尼沖擊結(jié)合逐步遞增濃度體外誘導(dǎo)獲得吉非替尼耐藥株P(guān)C-9/GR。用CCK-8法檢測細(xì)胞的耐藥指數(shù)，測定細(xì)胞群體倍增時(shí)間和細(xì)胞生長曲線，軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)觀察細(xì)胞的體外克隆形成能力，PI染色法和Annexin-v/7-AAD雙標(biāo)記法觀察細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，探討吉非替尼對PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞的治療反應(yīng)，PCR直接測序法分析PC-9細(xì)胞和

6、PC-9/GR細(xì)胞EGFR基因外顯子19、20序列，Western blot法檢測PC-9細(xì)胞和PC-9/GR細(xì)胞EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子的表達(dá)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測PC-9和PC-9/GR細(xì)胞p53蛋白表達(dá)。
　　 第三部分 CIK細(xì)胞對吉非替尼耐藥肺腺癌（PC-9/GR）細(xì)胞的殺傷效應(yīng)研究
　　 應(yīng)用細(xì)胞與裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)，比較觀察CIK細(xì)胞對PC-9和PC-9/GR細(xì)胞的殺傷率以及對移植瘤增殖的抑制效率，研究CIK

7、細(xì)胞與吉非替尼聯(lián)合應(yīng)用對耐藥株P(guān)C-9/GR的協(xié)同殺傷效應(yīng)。
　　 第四部分 CIK細(xì)胞輸注對腫瘤患者免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)
　　 為了進(jìn)一步理解CIK細(xì)胞過繼回輸可能的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制在應(yīng)對耐藥中的地位，對4例惡性腫瘤患者共6個(gè)療程回輸CIK細(xì)胞治療后的免疫內(nèi)環(huán)境進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察。CIK細(xì)胞過繼回輸采納新建的CO2循環(huán)供氣密閉波浪式CIK細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，流式細(xì)胞儀跟蹤C(jī)IK細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，CCK-8法檢測CIK細(xì)胞體外殺傷K-562

8、腫瘤細(xì)胞活力，分別于患者接受CIK細(xì)胞輸注前、輸注后1天、1周、2周、1月采集EDTA抗凝外周血，應(yīng)用流式細(xì)胞儀和液相芯片檢測分析免疫細(xì)胞亞群和細(xì)胞因子/趨化因子的動(dòng)態(tài)變化。與此同時(shí)，對新建體系與靜置培養(yǎng)系統(tǒng)體外擴(kuò)增培養(yǎng)CIK細(xì)胞的效率進(jìn)行了研究比較，并觀察了重組人IL-2撤除及凍存、復(fù)蘇對CIK細(xì)胞殺傷活性的影響，為建立高效、節(jié)能、具有質(zhì)量保障的CIK細(xì)胞臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化規(guī)范流程提供可參照模板。
　　 結(jié)果：
　　 第一

9、部分 吉非替尼對NSCLC的療效及其影響因素
　　 33例接受吉非替尼治療的患者，總體客觀緩解率為42.4％，中位疾病無進(jìn)展生存期為3.000（1.972～4.028）個(gè)月，單因素分析顯示血漿EGFR基因突變陽性的患者或不吸煙患者接受吉非替尼治療的客觀有效率和中位疾病無進(jìn)展生存期高于血漿EGFR基因突變陰性的患者或吸煙患者，P<0.05；多因素回歸分析顯示血漿游離核酸EGFR基因突變?yōu)榧翘婺嶂委熆陀^緩解率的唯一獨(dú)立影響因素（P

10、=0.002），而血漿游離核酸EGFR基因突變（P=0.007）、吸煙史（P=0.040）均為疾病無進(jìn)展生存期的獨(dú)立影響因素。
　　 在總共77例標(biāo)本中，檢出EGFR基因突變35例（45.5％），其中不吸煙患者腫瘤組織樣本中EGFR基因突變明顯高于吸煙患者（56.1％ vs.33.3％，P=0.045），但性別對EGFR基因突變率沒有明顯影響；在50例肺癌組織中，p53突變蛋白檢出率為48.0％ (24/50)，EGFR表達(dá)陽性

11、率為48.0％ (24/50)，p-Akt蛋白陽性率為48.0％ (24/50)，p-Erk蛋白陽性率為36.0％ (18/50)，p-Stat3蛋白陽性率為24.0％ (12/50)。P53突變蛋白在吸煙患者(61.5％，16/26)和EGFR基因野生型患者(60.7％，17/28)中的表達(dá)顯著高于不吸煙患者(33.3％，8/24)和EGFR基因突變患者(31.8％，7/22)，P<0.05，而p-Akt、p-Erk、p-Stat3蛋

12、白的表達(dá)與吸煙史、EGFR基因突變未見明顯相關(guān)性；進(jìn)一步分析吸煙對不同EGFR基因突變狀態(tài)NSCLC患者EGFR、p-Stat3、p-Erk、p-Akt、p53蛋白表達(dá)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在EGFR基因野生型肺癌中，吸煙與否與p53突變蛋白的表達(dá)并無相關(guān)性；而在EGFR基因突變型肺癌，吸煙患者p53突變蛋白檢出率則明顯高于不吸煙者，75.0％ vs.7.1％，P=0.02，其他各組未見統(tǒng)計(jì)學(xué)明顯差異。
　　 第二部分 吉非替尼耐藥人肺腺

13、癌PC-9細(xì)胞株的建立及其生物學(xué)特性
　　 經(jīng)大劑量吉非替尼沖擊結(jié)合逐步遞增濃度體外誘導(dǎo)，建立了能夠在10umol/L吉非替尼濃度下長期培養(yǎng)生長的細(xì)胞株，命名為肺腺癌吉非替尼耐藥株P(guān)C-9/GR。親本PC-9細(xì)胞群體細(xì)胞倍增時(shí)間是PC-9/GR細(xì)胞的1.64倍，經(jīng)CCK-8法檢測，PC-9/GR細(xì)胞的吉非替尼半數(shù)抑制濃度(IC50)是親代PC-9細(xì)胞的100.16倍，而對順鉑無交叉耐藥；吉非替尼作用后可呈劑量依賴性顯著抑制PC-

14、9的細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞G0/G1期周期阻滯和細(xì)胞凋亡，但對PC-9/G R細(xì)胞的作用較PC-9細(xì)胞明顯減低。
　　 第三部分 CIK細(xì)胞對吉非替尼耐藥肺腺癌（PC-9/GR）細(xì)胞的殺傷效應(yīng)研究
　　 CIK細(xì)胞對PC-9和PC-9/GR細(xì)胞體外殺傷活性無明顯差異，CIK細(xì)胞輸注對PC-9和PC-9/GR細(xì)胞移植瘤的生長都有一定的抑制作用，腫瘤生長速度明顯減慢，腫瘤組織重量顯著減輕，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.0

15、5，但CIK細(xì)胞輸注對腫瘤的抑制率在PC-9和PC-9/GR移植瘤之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；CIK細(xì)胞和吉非替尼同時(shí)作用于PC-9/GR細(xì)胞呈現(xiàn)一定的協(xié)同殺傷活性作用(CDI<1)，且隨著吉非替尼濃度的增加或CIK細(xì)胞效靶比的提高，二者的協(xié)同殺傷活性作用呈現(xiàn)增高的趨勢。
　　 第四部分 CIK細(xì)胞輸注對腫瘤患者免疫微環(huán)境的調(diào)節(jié)
　　 4例患者共進(jìn)行了6次CIK細(xì)胞體外擴(kuò)增，擴(kuò)增前外周血單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)為1.2×109～1.6×10

16、9個(gè)，CD3+CD56+細(xì)胞的比率為2.1％～4.4％。經(jīng)抗人CD3單抗、IFN-γ和IL-2刺激，循環(huán)供氣密閉波浪式培養(yǎng)體系培養(yǎng)21天后，細(xì)胞總數(shù)達(dá)到1.0×1010～1.5×1010個(gè)，CD3+CD56+細(xì)胞的比率為14.7％～31.0％，CD3+CD56+細(xì)胞絕對數(shù)達(dá)到1.26×109～4.65×109個(gè)，CIK細(xì)胞回輸后無明顯的毒/副反應(yīng)；患者在接受CIK細(xì)胞治療后外周血NK細(xì)胞比率逐漸增加、Treg細(xì)胞比率下降，在CIK細(xì)胞治

17、療后第2周、1月時(shí)與治療前相比，差異顯著，P<0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1、EGFR活性突變是NSCLC應(yīng)用吉非替尼分子靶向治療發(fā)揮療效的核心影響因素，吸煙易合并p53突變，與誘導(dǎo)耐藥密切相關(guān)。
　　 2、擁有吉非替尼靶標(biāo)合并p53突變的肺腺癌發(fā)生耐藥的機(jī)制，與選擇性獲得EGFR基因外顯子20 T790M突變細(xì)胞克隆有關(guān)，此克隆PI3K/Akt、MAPK/Erk1/2通路持續(xù)活化，對親本細(xì)胞敏感劑量范圍內(nèi)的

18、吉非替尼無反應(yīng)。
　　 3、CIK細(xì)胞對吉非替尼耐藥PC-9/GR細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷活性；與吉非替尼具有協(xié)同作用，并具有一定程度逆轉(zhuǎn)耐藥的效應(yīng)。
　　 4、CIK細(xì)胞過繼回輸能夠上調(diào)腫瘤患者體內(nèi)參與抗腫瘤天然免疫應(yīng)答的、發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)的NK細(xì)胞亞群，下調(diào)介導(dǎo)腫瘤免疫耐受的關(guān)鍵細(xì)胞因子和調(diào)節(jié)性T亞群，是一種具有臨床應(yīng)用價(jià)值的抗腫瘤個(gè)體化免疫調(diào)節(jié)模式。吉非替尼聯(lián)合CIK細(xì)胞過繼性回輸可能為我國特色性EGFR基因突變NSCLC