MUC1抗原模擬表位的篩選及鑒定.pdf

1、MUC1蛋白是一種高分子量糖蛋白,在人膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腺上皮細(xì)胞均有表達(dá).MUC1可作為免疫治療的靶點(diǎn)是基于以下特點(diǎn):(1)腫瘤細(xì)胞表達(dá)量增高,為正常的100倍以上;(2)腫瘤細(xì)胞MUC1廣泛分布,而正常細(xì)胞MUC1呈極性分布;(3)糖鏈的糖基化不全,導(dǎo)致正常情況下隱蔽的肽鏈表位暴露.MUC1的免疫原性區(qū)域主要位于該蛋白分子胞外段的20個(gè)氨基酸重復(fù)序列區(qū)域(VNTR).MUC1能引起T細(xì)胞免疫應(yīng)答 ,通過T細(xì)胞受體直接識(shí)

2、別,不受主要組織相容性復(fù)合體限制.MUC1還能引起B(yǎng)細(xì)胞免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體.目前已有多種基于MUC1的免疫原作為疫苗用于腫瘤治療的研究 ,有些已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段.為分析研究MUC1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系,了解其表面特性,本課題首先在方法學(xué)比較的基礎(chǔ)上,聯(lián)合運(yùn)用多種方法對(duì)MUC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和表面特性,如理化性質(zhì)、親水性、免疫原性等方面進(jìn)行分析和預(yù)測(cè).結(jié)果發(fā)現(xiàn): MUC1存在有多個(gè)潛在的抗原表位位點(diǎn); 位于胞外段的抗原表位位點(diǎn)見于VNTR

3、s(含PDTR) 140aa-156aa, 159aa-174aa,179aa-196aa.選擇針對(duì)該核心抗原表位的單抗,用于篩選隨機(jī)肽庫,有可能獲得其抗體識(shí)別的模擬表位.采用離子交換柱層析從腹水中純化了針對(duì)MUC1蛋白的鼠源性BC2抗體,洗脫液第3峰(命名為BC2 D3)含有純度較高的BC2抗體(22KD、52KD),經(jīng)Kodak成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描,所得BC2蛋白純度約為90﹪,可用于MUC1抗原模擬表位的篩選.運(yùn)用噬菌體隨機(jī)7肽庫技術(shù)

4、,以純化的BC2抗體為靶蛋白,進(jìn)行噬菌體隨機(jī)肽庫 3 輪篩選,根據(jù)插入?yún)^(qū)的核酸序列推導(dǎo)出外源多肽的氨基酸序列,獲得了MUC1抗原模擬表位TAPDLRP(x19),SAPDLRP(x9),AAPDSRP(x1)及 LAPDFRP (x1).比較所獲得的多肽氨基酸序列,依據(jù)其氨基酸序列同源程度,獲得其同源性基序:XAPDXRP.鑒定結(jié)果表明:4個(gè)噬菌體展示肽克隆抑制率均在50﹪以上,能較大程度地特異性抑制抗原抗體結(jié)合,提示這些陽性克隆的外源

5、肽具有一定的MUC1抗原模擬功能.為證實(shí)模擬抗原的免疫原性,進(jìn)一步用展示MUC1抗原模擬表位的噬菌體陽性克隆免疫小鼠,3次免疫小鼠后,血清(1:1000)中能檢測(cè)到較強(qiáng)的MUC1抗體陽性;以最大OD450值之純化血清做為一抗行蛋白印跡分析,結(jié)果顯示:純化血清可識(shí)別MUC1蛋白;小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖率檢測(cè)結(jié)果表明:噬菌體展示肽表位可在無佐劑存在情況下,大大促進(jìn)小鼠的脾淋巴細(xì)胞的增殖,證明噬菌體是一較好的生物載體.結(jié)果表明該模擬抗原免疫小鼠