利用噬菌體展示技術(shù)鑒定vvIBDV抗原表位及多表位模擬蛋白表達(dá).pdf

1、抗原表位，又稱抗原決定簇，是抗原分子抗原性的基礎(chǔ)?？乖砦皇堑鞍踪|(zhì)抗原性的物質(zhì)基礎(chǔ)。用于正確而詳細(xì)地繪制抗原表位圖譜對(duì)疾病地診斷、設(shè)計(jì)無毒副作用地多表位疫苗以及免疫治療試劑等具有積極的意義。因此目前在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域許多關(guān)于以表位為基礎(chǔ)的，如表位疫苗和特異性診斷試劑等的研究也就成了熱點(diǎn)。而噬菌體展示技術(shù)作為近年來新興起的研究蛋白質(zhì)抗原表位的有利工具，已經(jīng)成功地鑒定出了多種病原微生物地抗原表位。這就為揭示一些病原體未知地抗原表位，從而進(jìn)一步達(dá)

2、到預(yù)防和控制疾病地發(fā)生提供了條件。 傳染性法氏囊病(Infectiousbursaldisease，IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectiousbursaldiseasevirus，IBDV)引起的一種急性接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。IBDV主要侵害雛雞的中樞免疫器官--法氏囊，導(dǎo)致免疫抑制。且對(duì)其他疫病的易感性增強(qiáng)，飼養(yǎng)成本增加的同時(shí)導(dǎo)致藥物殘留，危害人類健康，造成經(jīng)濟(jì)損失。近年來，IBDV分子生物

3、學(xué)研究雖然己取得了較大進(jìn)展，但在分子水平對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒的免疫機(jī)理、致病機(jī)制、病毒分子結(jié)構(gòu)與功能方面仍然有許多問題有待于進(jìn)一步深入研究，而鑒定IBDV抗原表位有助于揭示病毒與機(jī)體相互作用的本質(zhì)，從而了解IBDV的致病機(jī)制和免疫機(jī)理。本研究共分兩個(gè)部分： 一、四株IBDV-VP2單抗的抗原表位的鑒定和序列分析為研究IBDV的免疫機(jī)理和致病機(jī)理，利用4株IBDVVP2單克隆抗體1B5、5D1、2H11和I-4-4-3作為篩選分

4、子，對(duì)噬菌體展示12肽庫進(jìn)行3輪“吸附一洗脫一擴(kuò)增”淘洗，從每株單克隆抗體篩選到的噬菌斑中隨機(jī)挑取15個(gè)單克隆藍(lán)色噬菌斑，合計(jì)60個(gè)，通過間接ELISA檢測(cè)，A40s值均大于1.00，且均大于陰性對(duì)照A405值的2倍；競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA分析，單克隆抗體和IBDV抗原均能競(jìng)爭(zhēng)抑制篩選12肽與固相包被單克隆抗體的反應(yīng)，抑制率大于40％，表明在該12肽內(nèi)含有IBDV抗原表位。選取20個(gè)單克隆噬菌斑(5個(gè)單克隆噬菌斑×4株單克隆抗體)，經(jīng)噬菌體

5、pⅢ部分基因的核苷酸序列測(cè)定，確定了4個(gè)優(yōu)勢(shì)12肽為不同IBDV抗原表位，這4個(gè)12肽在一級(jí)結(jié)構(gòu)上沒有3個(gè)以上連續(xù)氨基酸與GenBank中IBDVVP2的氨基酸序列相同之處，推測(cè)可能是構(gòu)象依賴性表位。 二、IBDV多表位模擬肽串聯(lián)基因的表達(dá)與免疫原性分析為研制抗原表位疫苗奠定基礎(chǔ)，本研究利用4株傳染性法氏囊病病毒(IBDVVP2)單克隆抗體(mAb)從噬菌體隨機(jī)肽庫中得到了4個(gè)含有不同IBDVVP2抗原表位的模擬肽序列。在此基礎(chǔ)

6、上，將4個(gè)抗原表位用GGGS四肽連接構(gòu)建多表位基因4epis。將該基因合成、克隆后，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-4epis，在大腸桿菌中表達(dá)重組多表位蛋白r4EPIS，經(jīng)掃描SDS-PAGE圖分析，r4EPIS菌體占總蛋白的20％、分子量30kDa。用IBDV的單克隆抗體和多克隆抗體對(duì)r4EPIS進(jìn)行免疫印跡對(duì)比分析，結(jié)果表明，r4EPIS具有IBDV特異性和免疫反應(yīng)性。將r4EPIS經(jīng)皮下注射免疫兔，第一次免疫7d后抗體效價(jià)為1:212，