赭曲霉毒素A模擬表位及無(wú)噬菌體的模擬表位肽ELISA的建立.pdf

1、赭曲霉毒素A(OchratoxinA.OTA）是指自然條件下在大麥，玉米等糧食作物被青霉菌、曲霉菌等污染后，產(chǎn)生的一種毒性危害大、可致突變、致畸和致癌的小分子化合物，建立高靈敏監(jiān)控手段是防止OTA污染食品進(jìn)入人類食物鏈的有效措施之一。酶聯(lián)免疫吸附方法（enzyme-linked immunoadsordent assay,ELISA）是用于OTA篩查檢測(cè)最常用方法，但建立檢測(cè)OTA的ELISA方法需要大量使用OTA毒素合成競(jìng)爭(zhēng)抗原，大量

2、接觸毒素對(duì)操作人員存在潛在的危害，因此尋找OTA毒素替代物，并建立簡(jiǎn)便、快速、高靈敏的OTA的篩查方法具有重要意義。
　　本研究利用商業(yè)化的噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)，通過(guò)改進(jìn)的淘選方法，得到了與抗OTA單克隆抗體2A11特異性結(jié)合的噬菌體模擬表位肽序列，并以此核心序列為模板，合成生物素化的肽段（生物素化的模擬抗原）為競(jìng)爭(zhēng)抗原，建立了無(wú)噬菌體的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，并應(yīng)用于玉米提取液中OTA的定量檢測(cè)。
　　具體研究過(guò)程如下：首先以

3、驢抗鼠二抗包被酶標(biāo)孔，并進(jìn)一步定向結(jié)合抗OTA單克隆抗體2A11。加入噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)與單抗結(jié)合，前三輪富集采用酸洗脫，第四輪富集采用超低濃度的OTA（0.1ng/mL）競(jìng)爭(zhēng)洗脫。經(jīng)鑒定隨機(jī)挑選的30個(gè)噬菌體粒子均為與抗體2A11具有結(jié)合能力的陽(yáng)性噬菌體粒子，其中16個(gè)噬菌體粒子在OTA濃度為0.1ng/mL顯示較高的競(jìng)爭(zhēng)抑制率。挑選這16株噬菌體測(cè)序，得到6個(gè)不同的肽段序列。其中序列為“GMVQTIF”的噬菌體粒子具有最高的檢測(cè)靈敏度

4、。
　　其次，以GMVQTIF序列為模板，合成生物素化的12肽（生物素化的模擬抗原）“GMVQTIF-GGGSK-biotin”為競(jìng)爭(zhēng)抗原，建立直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA。在最優(yōu)的條件下，基于模擬肽為競(jìng)爭(zhēng)抗原的ELISA檢測(cè)OTA的線性范圍為0.005ng/mL—0.2ng/mL，半數(shù)抑制濃度(IC50值)為0.024ng/mL，最低檢出限為0.001ng/mL,與商業(yè)化ELISA試劑盒相比靈敏度提高了5倍。通過(guò)BLI分析了生物素化的模擬

5、肽和OTA全抗原與抗體的親和常數(shù)，結(jié)果表明抗體2A11與生物素化的模擬表位親和力遠(yuǎn)低于與普通OTA全抗原親和力。特異性實(shí)驗(yàn)表明，本實(shí)驗(yàn)建立的ELISA方法與黃曲霉毒素B1、伏馬毒素 B1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇以及玉米赤霉烯酮無(wú)交叉反應(yīng)。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)玉米加標(biāo)樣品批內(nèi)回收率在98.7％-120.3%，變異系數(shù)在3%-10%之間，批間回收率在97.4%-105.2%之間，批間變異系數(shù)8%-20%，以上數(shù)據(jù)表明本實(shí)驗(yàn)方法具有良