血紅素加氧酶-1(HO-1)的多抗制備及其抗原表位的篩選.pdf

1、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是體內(nèi)唯一可被誘導(dǎo)的血紅素加氧酶，能夠降解血紅素為等摩爾一氧化碳、膽綠素和鐵離子。在多種細(xì)胞中，它均能受到很多因素誘導(dǎo)而高表達(dá)，例如：血紅素、炎癥細(xì)胞素、加熱、重金屬、激素、紫外線、缺氧和一氧化氮等，被誘導(dǎo)的HO-1發(fā)揮抗炎及調(diào)節(jié)凋亡的作用。研究表明，HO-1與很多疾病相關(guān)，如：腫瘤、腸炎、膿毒血癥、氧驚厥、神經(jīng)元退行性病變、缺血性腦損傷、動脈粥樣硬化、哮喘、高血壓等。在體內(nèi)

2、，表達(dá)的HO-1抑制內(nèi)毒素性休克、(組織內(nèi))氧過多、急性胸膜炎以及器官移植和缺血-再灌注損傷中的炎癥應(yīng)答，從而在這些條件下，提供有益的幫助。許多證據(jù)表明，在很多疾病模型中，HO-1及其產(chǎn)物膽紅素/膽綠素能利用其抗炎、抗凋亡、抗增殖及抗氧化特性，來調(diào)節(jié)其保護(hù)作用。HO-1在許多疾病中活性都有提高，因此，對于HO-1在相關(guān)疾病中的作用，以及研究HO-1活性變化在相關(guān)疾病的診斷、治療的作用方面，都需要對相關(guān)疾病中HO-1活性進(jìn)行抑制。而中和抗

3、體能中和抗原的活性，即抑制抗原活性。因此，我們需要得到HO-1的中和抗體并篩選出其抗原表位。
　　 我們表達(dá)及純化HO-1，制備其中和抗體，篩選抗原表位，為以后的相關(guān)研究、臨床診斷、治療及預(yù)后奠定了一定的基礎(chǔ)。確定人血紅素加氧酶-1(hHO-1)和重組大鼠血紅素加氧酶-1(△rHO-1)在大腸桿菌中表達(dá)條件與純化方法，并且利用純化好的蛋白制備中和抗體，利用噬菌體肽展示庫篩選出其抗原表位，并制備其多克隆抗體，利用制備好的表位多抗對

4、其進(jìn)行驗證。
　　 首先酶切鑒定原核表達(dá)質(zhì)粒pMW172/hHO-1及pMW172/△rHO-1，并對其進(jìn)行測序，鑒定正確后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21，通過改變搖床轉(zhuǎn)速及IPTG濃度確定可溶性HO-1的最佳表達(dá)條件。為了避免HO-1的酶活性損失，盡量簡化純化步驟，利用超聲波及高速離心去除大量菌體蛋白，又用分級鹽析最大限度地保留了HO-1，除去了雜蛋白，S-200柱層析進(jìn)一步通過分子量差異將雜蛋白分離，通過體外HO-1活性測定方法檢測

5、得到HO-1蛋白的活性。之后，利用純化的HO-1蛋白作為抗原免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體，利用ELISA方法測定其效價，以及Western-Blot技術(shù)檢測抗體的特異性，并用HO-1活性測定方法測定抗體的中和活性。利用噬菌體肽展示庫技術(shù)對HO-1中和型多抗進(jìn)行篩選，得到HO-1抗原表位，測序后，經(jīng)序列比對分析，合成可能具有中和活性的抗原表位肽段，免疫新西蘭兔，制備其多克隆抗體。進(jìn)而，通過HO-1體外活性測定方法測定抗體的中和活性，驗證其

6、是否具有中和活性的抗原表位。
　　 本課題的實驗結(jié)果：①原核表達(dá)質(zhì)粒pMW172/hHO-1經(jīng)測序后，HO-1基因長度為938bp，測序正確。將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后成功表達(dá)了可溶性的活性hHO-1。②超聲破碎菌體，hHO-1上清經(jīng)30％-40％鹽析純化及分子篩層析純化，獲得活性hHO-1蛋白，收得率為30.3％，純化倍數(shù)為2.83倍，純度為90％。③利用純化后的hHO-1制備出抗hHO-1兔血清，經(jīng)ELISA測定效價達(dá)到10

7、6，Western-Blot顯示抗體特異性識別hHO-1。對抗體進(jìn)行中和活性的測定，證實抗體能中和掉46％hHO-1的催化活性。④原核表達(dá)質(zhì)粒pMW172/△rHO-1經(jīng)測序后，HO-1基因長度為792bp，測序正確。將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21后成功表達(dá)了可溶性的活性△rHO-1。⑤超聲破碎菌體，△rHO-1上清經(jīng)35％-55％鹽析純化及分子篩層析純化，獲得活性△rHO-1蛋白，收得率為34.5％，純化倍數(shù)為1.61倍，純度為95％。⑥利

8、用純化后的△rHO-1制備出抗△rHO-1兔血清，經(jīng)ELISA測定效價超過1.3×107，Western-Blot顯示抗體特異性識別△rHO-1。對抗體進(jìn)行中和活性的測定，證實抗體能中和掉72.6％△rHO-1的催化活性。⑦同時，對抗△rHO-1多克隆抗體進(jìn)行了與hHO-1交叉反應(yīng)性的檢測，ELISA及Western-Blot均證實抗△rHO-1多抗可以用于hHO-1的檢測。即，HO-1功能區(qū)是相同的。⑧利用噬菌體肽展示庫技術(shù)對純化后抗

9、△rHO-1IgG進(jìn)行表位篩選，得到12條肽段。⑨對篩選到的12條肽段測序后，得到了四個肽段組：A1組、A13組、A3組以及A7組，經(jīng)序列比對分析及克隆數(shù)目的多少，初步判斷A1和A13肽段最可能是中和表位，對A1、A1的天然肽及A13進(jìn)行合成，制備出肽段多抗。⑩通過驗證證實，抗A13的抗體可以中和掉38.7％的△rHO-1催化活性，具有中和HO-1活性的功能，為中和表位，A1和天然肽為結(jié)合表位。
　　 由以上結(jié)果得出如下結(jié)論：通