血紅素加氧酶-1介導(dǎo)Tr1細(xì)胞抑制哮喘氣道炎癥的研究.pdf

1、背景： 血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）是血紅素代謝途徑中的限速酶，將血紅素降解為等量的膽綠素、CO和亞鐵離子，膽綠素經(jīng)膽綠素還原酶生成膽紅素。HO有三種同工酶，即誘導(dǎo)型HO-1，組成型HO-2及近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的異構(gòu)體HO-3。其中HO-1又為應(yīng)激蛋白，具有顯著的抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡和抗平滑肌增生作用。HO-1及其降解產(chǎn)物膽綠素、膽紅素和CO均具有抗炎和抗氧化應(yīng)激效應(yīng)，在抑制支氣管哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展中

2、起著重要的作用。 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）有多種亞群，按其來(lái)源可分為天然發(fā)生的T調(diào)節(jié)細(xì)胞（naturally occurring regulatory T cells，nTreg）和誘導(dǎo)性T調(diào)節(jié)細(xì)胞（inducing regulatory T cells，iTreg）。nTreg主要是胸腺來(lái)源的CD4+CD25+Treg，約占外周血CD4+T細(xì)胞的5％~10％，是Treg細(xì)胞的主要組成部分。

3、iTreg可以由CD4+T細(xì)胞在特定的條件如細(xì)胞因子作用下誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且選擇性地表達(dá)調(diào)節(jié)活性，Tr1是iTreg中最為重要的細(xì)胞亞群，通常受外周高濃度抗原刺激后從na?ve T細(xì)胞分化而來(lái)，免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10是Tr1產(chǎn)生的動(dòng)力，而Tr1又通過(guò)分泌IL-10調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，抑制體內(nèi)外na?ve T細(xì)胞和記憶性T細(xì)胞反應(yīng)。到目前為止，Treg的具體作用機(jī)制尚未完全闡明。 關(guān)于哮喘的發(fā)病機(jī)制目前尚未明確，但氣道慢性炎癥被認(rèn)為是

4、哮喘的本質(zhì)。鑒于HO-1和Tr1在哮喘防治中所起的保護(hù)作用，推測(cè)HO-1通過(guò)誘導(dǎo)Tr1細(xì)胞分化，增加IL-10分泌，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)進(jìn)而抑制哮喘氣道炎癥。 目的： 利用體外細(xì)胞培養(yǎng)和哮喘動(dòng)物模型，上調(diào)HO-1表達(dá)，分析HO-1與Tr1/IL-10和哮喘間的關(guān)系，探討HO-1介導(dǎo)Tr1細(xì)胞、促進(jìn)IL-10分泌以拮抗哮喘氣道炎癥。 方法： 體外實(shí)驗(yàn)：MACS 磁珠分選naive CD4+T細(xì)胞，B7H1/IL-1

5、0誘導(dǎo)培養(yǎng)，并經(jīng)血紅素（Hemin）和錫-原卟啉（Sn-protoporphyrin，SnPP）共培養(yǎng)干預(yù)。分別在3，7，10和14天收集細(xì)胞進(jìn)行三色熒光標(biāo)記抗體染色：anti-CD4-APC、anti-IL-10R-PE、Biotinylated anti-IFN-γR和anti-Biotin-FITC，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定三標(biāo)記均陽(yáng)性的細(xì)胞即Tr1的比例。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏、激發(fā)C57B6小

6、鼠建立哮喘模型，并在致敏、激發(fā)階段分別經(jīng)Hemin和SnPP干預(yù)。肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)和肺臟病理組織學(xué)檢測(cè)評(píng)價(jià)哮喘氣道炎癥；Real-Time PCR和Western blot方法分別測(cè)定脾臟細(xì)胞內(nèi)HO-1、IL-10 mRNA表達(dá)和HO-1蛋白量；ELISA方法測(cè)定動(dòng)物血清OVA-特異性IgE（OVA-sIgE）和IL-10水平；流式細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定脾臟細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+IL-10R+IFN-γR+Tr1，CD4+ IL-10

7、R+IFN-γR+IL-10+Tr1的比例；流式細(xì)胞儀分選Tr1細(xì)胞并測(cè)定其抑制效應(yīng)T細(xì)胞增殖功能。 結(jié)果： 體外實(shí)驗(yàn)：Hemin誘導(dǎo)HO-1高表達(dá)后不能直接誘導(dǎo)naive CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)r1。 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：OVA致敏、激發(fā)的哮喘小鼠模型，經(jīng)Hemin干預(yù)后，Tr1比例增加，脾臟細(xì)胞HO-1和IL-10 mRNA 表達(dá)上調(diào)，HO-1蛋白水平明顯增加，血清IL-10水平增高，哮喘氣道炎癥減輕。 結(jié)論：