水稻血紅素加氧酶1(OsHO1)基因克隆、功能分析及其催化底物氯化血紅素和羥鐵血紅素的生物學(xué)功能研究.pdf

1、血紅素加氧酶（heine oxygenase，HO，EC1.14.99.3）催化降解血紅素(heme)，生成膽綠素( biliverdin,BV)，一氧化碳(carbon monoxide，CO)和亞鐵離子(ferrous iron,Fe2+)．動(dòng)物中大量研究表明，HO具有抗炎癥、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)微循環(huán)等生物活性，在許多生理和病理過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用．近年來的研究發(fā)現(xiàn)，植物體HO除了參與合成光敏色素發(fā)色團(tuán)所必需及響應(yīng)光周期變化外

2、，還具有諸如參與氣孔關(guān)閉進(jìn)程、誘導(dǎo)側(cè)根和不定根發(fā)生、緩解脅迫導(dǎo)致的氧化傷害等功能．
　　 本研究以水稻（Oryza sativa L．）為材料，根據(jù)先前報(bào)道的SE5基因（血紅素加氧酶l，OsH01）序列，通過設(shè)計(jì)引物，克隆了SE5基因的CDS區(qū)序列，其開放閱讀框長為870 bp，編碼289個(gè)氨基酸殘基的多肽。多序列比對(duì)結(jié)果表明，OsHO1舍有結(jié)合heine的His位點(diǎn)，且具有血紅素加氧酶1的保守特征序列，并與植物其他HO1蛋白一

3、樣，具有高度的保守性；通過預(yù)測其蛋白序列的信號(hào)肽切割位點(diǎn)，通過構(gòu)建水稻成熟HO蛋白基因的原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中成功表達(dá)了融合6×His的成熟HO1（His-mOsHO1）蛋白，經(jīng)金屬離子親和純化，得到純度較高的融合蛋白．通過酶活性測定，發(fā)現(xiàn)其具有催化heme降解并產(chǎn)生BV的特征峰；通過進(jìn)一步對(duì)其生化特性的研究表明：His-mOsHO1酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax為63.3 nmol BV IXa h-1 mg-1protein; Km值

4、為2.9μM hemin;最適pH值為7.0；最適溫度在一定范圍(10-45℃)內(nèi)呈遞增的趨勢。此外，通過構(gòu)建融合了OsHO1導(dǎo)肽基因序列的綠色熒光蛋白(GFP)基因載體，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草葉片表皮的瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果表明OsHO1至少定位在葉綠體中。
　　 將純化得到的His-mOsHO1制備抗體，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗體的特異性。同時(shí)，結(jié)合RT-PCR，研究了SE5基因在水稻不同部位的組織分布特性。結(jié)果表明：OsHO1基因在水稻莖、葉

5、子和萌發(fā)的種子中的表達(dá)量要明顯高于根和胚芽；Western blot的結(jié)果證實(shí)，OsHO1蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)出與RT-PCR相一致的結(jié)果。采用非生物脅迫(NaCl和PEG)處理水稻幼苗后發(fā)現(xiàn)，OsHO1基因的表達(dá)可以受脅迫誘導(dǎo)，并隨處理時(shí)間呈現(xiàn)出一定的遞增趨勢，且處理后根和葉片的誘導(dǎo)具有一定的相似性。這些結(jié)果暗示，SE5基因可能是受脅迫誘導(dǎo)的基因，并可能在脅迫中起到一定的作用．
　　 構(gòu)建SE5基因的RNAi過表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介

6、導(dǎo)的水稻愈傷轉(zhuǎn)化及擬南芥花序侵染，分別篩選得到了過表達(dá)．SE5基因的轉(zhuǎn)基因水稻和擬南芥，并通過PCR驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)基因植株。初步的生理學(xué)試驗(yàn)表明，過表達(dá)SE5基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥可以緩解百草枯處理引起的種子萌發(fā)抑制及氧化傷害．
　　 利用HO催化底物血紅素的基團(tuán)取代物heroin和hematin（氯化血紅素和羥鐵血紅素）預(yù)處理或者共處理鹽脅迫下小麥和水稻種子，發(fā)現(xiàn)兩者均可以不同程度地緩解鹽脅迫導(dǎo)致的種子萌發(fā)抑制（包括發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)

7、芽指數(shù)）．進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，hemin和hematin緩解鹽脅迫下種子萌發(fā)的抑制可能與其提高種子中淀粉酶活性、還原糖和可溶性總糖、相關(guān)抗氧化酶轉(zhuǎn)錄本及活性有關(guān)；當(dāng)采用CO清除劑Hb、HO酶活性抑制劑ZnPP時(shí)，heroin和hematin的緩解效應(yīng)則被不同程度地逆轉(zhuǎn)，暗示hemin和hematin可能通過誘導(dǎo)HO催化產(chǎn)生的CO起作用；此外，一氧化氮(nitric oxide，NO)清除劑亞甲基藍(lán)（methylene blue，MB）處理