血紅素和西羅血紅素分支合成關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究.pdf

1、1．玉米尿卟啉原甲基化酶的功能片段的確定依賴于S-腺苷甲硫氨酸的尿卟啉原甲基化酶(S-adenosyl-L-methionine：uroporphyrinogen methyltransferase，SLJMT)是微生物合成西羅血紅素、血紅素d1、F<,430>因子和維生素B<,12>等卟吩烷類化合物的重要調(diào)控酶，植物中SUMT負(fù)責(zé)西羅血紅素生物合成的調(diào)控。SUMT催化尿卟啉原Ⅲ在C2和C7位的甲基化，大腸桿菌重組表達(dá)的SUMT會(huì)在細(xì)胞

2、中積累西羅葉綠三酸和過甲基化產(chǎn)物三甲基咕啉，它們?cè)谧贤夤庀庐a(chǎn)生強(qiáng)烈紅色熒光，這種性質(zhì)可用于檢測SUMT在重組系統(tǒng)的體內(nèi)酶活。 利用不同的限制性內(nèi)酶切，將編碼玉米SUMT的基因切成不同片段，分別插入不同的表達(dá)載體中，表達(dá)的蛋白分別是玉米SUMT，含有葉綠體導(dǎo)肽的SUMT前體，切除SUMT的N端S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合模塊的截頭突變體，和切除SUMT的C端52個(gè)氨基酸殘基的截尾突變體。其中，SUMT和截尾突變體N端含有組氨酸標(biāo)簽。將所

3、有重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，結(jié)果顯示表達(dá)融合葉綠體導(dǎo)肽的SUMT前體和截頭突變體的重組大腸桿菌菌落沒有紅色熒光。蛋白檢測顯示表達(dá)的重組蛋白為包涵體，表明葉綠體導(dǎo)肽和SAM結(jié)合模塊影響酶在大腸桿菌中的折疊。而表達(dá)SUMT的N端分別融合表達(dá)一段13個(gè)氨基酸殘基的寡肽、或組氨酸標(biāo)簽，或麥芽糖結(jié)合蛋白，重組大腸桿菌菌落顯示紅色熒光；表達(dá)截尾突變體的重組菌落顯示紅色熒光，表明SUMT的C端52個(gè)氨基酸殘基對(duì)酶活沒有顯著作用。 分

4、別將表達(dá)玉米SUMT和截尾突變體的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌S13009，誘導(dǎo)表達(dá)，利用Ni-NTA層析一步純化了玉米SUMT及截尾突變體，純度在90％以上。玉米SUMT的亞基分子量在SDS-PAGE上測定約34 kD，凝膠層析測得全酶分子量為52 kD，動(dòng)態(tài)光散射測定全酶分子量約79 kD，表明玉米SUMT是同亞基二聚體。純化的蛋白結(jié)合紅色熒光色素。 從純化的玉米SUMT中分離色素，利用紫外-可見光譜和熒光光譜確定酶結(jié)合色素的主要

5、成分是三甲基咕啉，而玉米SUMlT氨基酸殘基干擾結(jié)合色素的熒光激發(fā)峰。圓二色性分析表明，去除色素后，玉米SUMT的二級(jí)結(jié)構(gòu)有輕微改變，對(duì)色素的產(chǎn)生及結(jié)合蛋白的可能機(jī)制進(jìn)行了討論。 2.枯草桿菌尿卟啉原脫羧酶的結(jié)構(gòu)研究尿卟啉原脫羧酶(Uroporphyrinogen decarboxylase，UROD)是血紅素和葉綠素分支合成的第一個(gè)酶，控制著生物體內(nèi)不同卟啉化合物代謝的流向。它催化尿卟啉原Ⅲ或異構(gòu)體尿卟啉原Ⅰ四次脫羧產(chǎn)生糞卟啉

6、原Ⅲ或Ⅰ，和一般的脫羧酶不同，UROD不含有輔因子。 利用PCR技術(shù)從枯草桿菌(Bacillus subtilis)基因組DNA擴(kuò)增了編碼UROD的基因hemE，測序顯示編碼的UROD有兩個(gè)氨基酸殘基發(fā)生改變，分別是Ile155被Thr155取代，Glu198被Lys198取代，擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后插入pET15b中，表達(dá)的枯草桿菌UROD(B.subtilis UROD，bsUROD)N端含有組氨酸標(biāo)簽，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL

7、21(DE3)，Ni-NTA一步純化，蛋白純度在90％以上。酶的比活為560 U/mg蛋白。純化的bsUROD亞基分子量在SDS-PAGE上測定約41kD，動(dòng)態(tài)光散射測定全酶分子量約81 kD，表明bsUROD是同亞基二聚體。 利用懸滴法獲得bsUROD的晶體，收集到分辨率為2.3 A的晶體衍射數(shù)據(jù)，以人UROD的結(jié)構(gòu)作為模型，利用分子置換法解析了bsUROD的晶體結(jié)構(gòu)，晶體空間群為P<,1>，在bsUROD的模型中，一個(gè)晶胞

8、中有四個(gè)UROD單體，晶胞參數(shù)a=58.612A，b=80.410A，c=90.940 A，α=68.681°，β=89.638°，γ=80.817°，bsUROD的最終模型的自由R因子和晶體學(xué)R因子分別為19.74％和25.13％，鍵長和鍵角的RMSD分別為0.012 A和1.290°。bsUROD的結(jié)構(gòu)已經(jīng)投入PDB(PDB code：2INF)。 解析的bsUROD單體結(jié)構(gòu)包括6-88和101-349氨基酸殘基，單體只有

9、一個(gè)結(jié)構(gòu)域，由(β/α)<,8>桶折疊組成，酶活中心呈現(xiàn)凹穴結(jié)構(gòu)，利用hUROD和產(chǎn)物糞卟啉Ⅲ的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，將糞卟啉Ⅲ的結(jié)構(gòu)和bsUROD進(jìn)行空間疊合，結(jié)果顯示，bsUROD酶活中心有18個(gè)氨基酸殘基和糞卟啉Ⅲ有接觸，根據(jù)對(duì)底物的識(shí)別和脫羧的功能將它們分為3類。第一類是Asp殘基；第二類包含數(shù)個(gè)極性氨基酸殘基；第三類包括數(shù)個(gè)疏水氨基酸殘基。在18個(gè)氨基酸殘基中，只有Arg29，Arg33，Asp78，Ile79，Phe104，Tyr15

10、4，Phe207和His322在30個(gè)物種的UROD中是不變的。對(duì)它們可能的功能作了討論。 bsUROD和真核生物UROD結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)loop差別很大，這兩個(gè)loop的構(gòu)象變化可能涉及底物的結(jié)合和產(chǎn)物的釋放。由于UROD和SUMT催化相同的底物，推測SUMT結(jié)合尿卟啉原吡咯環(huán)NH基團(tuán)的氨基酸殘基和bsUROD-致。根據(jù)bsUROD和催化產(chǎn)物的模擬結(jié)構(gòu)，我們提出了一種新的催化機(jī)制，bsUROD中Arg29可能參與脫羧，而Ph

11、e144和/或Phe207可能參與捕獲二氧化碳分子。 3．參與血紅素，西羅血紅素和NAD生物合成的酶的純化及結(jié)晶生物中血紅素和西羅血紅素是個(gè)多功能分子，參與它的生物的酶的結(jié)構(gòu)和功能的研究近年來有很大進(jìn)展。3-羥鄰氨基苯甲酸雙加氧酶(3-Hydroxyanthranilicacid 3，4-dioxygenase，HAO)是NAD合成途徑中關(guān)鍵調(diào)控酶。 我們分別克隆、表達(dá)和純化了枯草桿菌合成血紅素的上游和中游的酶，以及西