利用合成生物學(xué)方法構(gòu)建感應(yīng)亞鐵血紅素的動(dòng)態(tài)元件調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄.pdf

1、合成生物學(xué)是生物學(xué)領(lǐng)域近幾年興起的一種重要研究手段，也是將多學(xué)科研究方法相結(jié)合而產(chǎn)生的前沿學(xué)科。它是以人工設(shè)計(jì)和構(gòu)建核心元件為主要思路，將其合理組合優(yōu)化，形成工程化、標(biāo)準(zhǔn)化、可替換的功能模塊，合成諸如酶分子、基因環(huán)路、生命形態(tài)等。合成生物學(xué)中的元件被賦予工程學(xué)上的模塊化性質(zhì)，可以在更大規(guī)模的設(shè)計(jì)中進(jìn)行組合從而實(shí)現(xiàn)更大規(guī)模的生物工程學(xué)改造。目前，合成生物學(xué)這一研究方法已在生物醫(yī)藥、生物能源、生命合成等方面取得許多重要進(jìn)展。
　　亞鐵

2、血紅素是生物體內(nèi)卟啉化合物的一種重要形式，由原卟啉Ⅸ中的四個(gè)吡咯環(huán)與Fe2+螯合而成，在生物體正常代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的功能，在大腸桿菌中血紅素是由重要的中間產(chǎn)物5-氨基乙酰丙酸(ALA)轉(zhuǎn)化而來(lái)。ALA是大腸桿菌中所有吡咯化合物的前體物質(zhì)，在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都具有非常廣闊的應(yīng)用前景，目前對(duì)微生物代謝改造生產(chǎn)ALA的研究得到普遍關(guān)注。在這一途徑中，血紅素一方面參與呼吸過(guò)程影響大腸桿菌中心代謝，另一方面它的合成偶聯(lián)呼吸電子傳遞鏈產(chǎn)生能量，

3、從而影響大腸桿菌能量產(chǎn)生方式以及代謝流的分配。
　　本實(shí)驗(yàn)室在改造代謝途徑積累ALA的課題研究發(fā)現(xiàn)，ALA作為光敏感的中間產(chǎn)物，其積累受到上下游基因共同影響，單純過(guò)表達(dá)某些上游基因或弱化下游基因往往得不到較好的效果，并且血紅素作為該路徑上的終產(chǎn)物經(jīng)常會(huì)在胞內(nèi)過(guò)剩積累，這樣不僅會(huì)造成能量的浪費(fèi)，并且會(huì)影響ALA積累。因此，針對(duì)這一問(wèn)題，動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)血紅素水平顯得尤為重要。本研究從這一點(diǎn)出發(fā)，利用合成生物學(xué)思路和方法，結(jié)合代謝工程的

4、研究背景，構(gòu)建了一個(gè)含IRRrl-Pice和CI-Pci兩個(gè)阻遏元件和帶有降解標(biāo)簽的gfp-ssrA報(bào)告基因組成的動(dòng)態(tài)感應(yīng)血紅素調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控組件。
　　本研究選取的感應(yīng)血紅素的關(guān)鍵蛋白是從豆科根瘤菌中找到的IRRrl蛋白，同時(shí)引入來(lái)自入噬菌體的負(fù)調(diào)控元件CI-Pci，以及在報(bào)告基因后面加入恒定講解標(biāo)簽ssrA以減少構(gòu)建過(guò)程中菌體的表達(dá)壓力。在正常情況下，IRRrl蛋白可以與Pice啟動(dòng)子上的ICE序列結(jié)合阻遏后面基因轉(zhuǎn)錄

5、。在胞內(nèi)血紅素含量較高時(shí)，IRRrl蛋白可以與血紅素結(jié)合改變自身構(gòu)象，Pice激活下游CI蛋白轉(zhuǎn)錄，CI蛋白表達(dá)與Pci啟動(dòng)子結(jié)合發(fā)揮阻遏效應(yīng)，報(bào)告基因gfp-ssrA轉(zhuǎn)錄關(guān)閉;當(dāng)血紅素水平較低時(shí)，血紅素執(zhí)行自身功能不與IRRrl蛋白結(jié)合， Pci啟動(dòng)子不受抑制，報(bào)告基因得以表達(dá)。若將此處的報(bào)告基因換成血紅素合成途徑上游的基因，便可根據(jù)血紅素濃度高低動(dòng)態(tài)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而提高中間產(chǎn)物ALA的積累。
　　本研究進(jìn)一步對(duì)構(gòu)建的動(dòng)態(tài)感應(yīng)

6、血紅素元件進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)分析單個(gè)啟動(dòng)子的啟動(dòng)功能、單個(gè)及串聯(lián)元件的開(kāi)關(guān)效果，亞鐵離子對(duì)于開(kāi)關(guān)的影響，驗(yàn)證了調(diào)控元件對(duì)于鐵離子濃度的感應(yīng)效果以及與胞內(nèi)血紅素結(jié)合后對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)整變化。具體包括:首先以DH5α菌株為背景驗(yàn)證單個(gè)啟動(dòng)子功能，分別將Pci和Pice啟動(dòng)子同gfp-ssrA組裝到pUC19質(zhì)粒骨架上，構(gòu)建了質(zhì)粒pGFPⅠ和pGFPⅡ，在16h內(nèi)熒光持續(xù)積累，單位OD熒光值呈上升趨勢(shì)，說(shuō)明外源的Pci和Pice啟動(dòng)子可以在大腸桿菌

7、中很好地啟動(dòng)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄。其次驗(yàn)證單個(gè)元件的功能，構(gòu)建了質(zhì)粒pGFPⅢ和pGFPⅣ，由于lac啟動(dòng)子關(guān)閉不嚴(yán)，在DH5α菌株中誘導(dǎo)阻遏蛋白后沒(méi)有出現(xiàn)足額現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加一定濃度的葡萄糖，或者將背景菌株更換為來(lái)源于菌株MC1061的TOP10菌株，均可以抑制lac啟動(dòng)子泄露，從而使開(kāi)關(guān)效應(yīng)更加嚴(yán)謹(jǐn)、靈敏。之后構(gòu)建了質(zhì)粒GFPⅢ2和pGFPⅣ2，搖瓶發(fā)酵曲線上看表達(dá)阻遏蛋白后5h左右可以明顯出現(xiàn)抑制啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象。最后，將兩個(gè)負(fù)