血紅素對(duì)斑馬魚(yú)胰腺外分泌酶原基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制.pdf

1、目標(biāo)：探究血紅素對(duì)斑馬魚(yú)胰腺外分泌酶原基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制，為卟啉癥的診斷和治療提供分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的理論依據(jù)。同時(shí)進(jìn)一步闡明血紅素作為信號(hào)分子發(fā)揮功能的具體信號(hào)通路。
　　 方法：本實(shí)驗(yàn)分七個(gè)部分研究血紅素對(duì)斑馬魚(yú)胰腺外分泌酶原基因表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。(1)通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR確定血紅素能夠控制胰腺外分泌酶原基因(cpa5，ctr1l，ctrb1，ela2l，try，tryl)的表達(dá)(2)運(yùn)用原位雜交實(shí)驗(yàn)探究關(guān)鍵調(diào)控因子

2、bach1和nrf2在斑馬魚(yú)胚胎中的表達(dá)情況。(3)通過(guò)雙色原位雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)關(guān)鍵調(diào)控因子bach1和nrf2同時(shí)在斑馬魚(yú)胰腺中表達(dá)。(4)通過(guò)5’-RACE和3’-RACE實(shí)驗(yàn)獲得bach1基因的mRNA序列信息，并克隆bach1基因編碼區(qū)序列，構(gòu)建bach1基因表達(dá)載體。(5)通過(guò)顯微注射cappedmRNA進(jìn)行bach1和nrf2基因的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。(6)通過(guò)顯微注射嗎啉環(huán)修飾的反義寡核苷酸(MO，Morpholinoantisens

3、eoligonucleotides)進(jìn)行bach1和nrf2基因的敲降實(shí)驗(yàn)。(7)電泳遷移率實(shí)驗(yàn)(EMSA)證實(shí)了斑馬魚(yú)的MafK蛋白能夠結(jié)合到胰腺外分泌酶原基因上游的MARE(Mafrecognitionelement)元件上。
　　 結(jié)果：(1)血紅素合成缺陷的斑馬魚(yú)突變體中6個(gè)胰腺外分泌酶原基因的表達(dá)下調(diào)，同時(shí)氯高鐵血紅素(hemin)能夠使突變體中的這些下調(diào)的胰腺外分泌酶原基因的表達(dá)有所恢復(fù)。(2)bach1基因在斑馬魚(yú)

4、胚胎的頭部、軀干部、內(nèi)臟部位均有表達(dá)。nrf2基因在斑馬魚(yú)胚胎的內(nèi)臟部位、頭部、軀干部的神經(jīng)節(jié)點(diǎn)部位表達(dá)。(3)bach1和nrf2基因都在斑馬魚(yú)的胰腺中表達(dá)。(4)獲得了bach1基因的序列信息和表達(dá)載體。(5)bach1基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致6個(gè)胰腺外分泌酶原基因下調(diào)，相反，nrf2基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致6個(gè)胰腺外分泌酶原基因上調(diào)。(6)bach1基因的敲降導(dǎo)致6個(gè)胰腺外分泌酶原基因上調(diào)，相反，nrf2基因的敲降導(dǎo)致6個(gè)胰腺外分泌酶原基因下調(diào)。